Biochemische und funktionelle Untersuchungen der Transposase des Activator-Elements aus Zea mays

Das Ac-Element aus Zea mays, das zur Familie der hAT-Elemente
gehört, codiert für ein einzelnes Protein, die Transposase (TPase).
Dieses Protein ist in vivo als einziges essentiell für die
Transposition von Ac notwendig. Die Expression der TPase in E. coli
war bisher nur in unlöslicher Form möglich. Der Nachweis, daß die
TPase in vitro an die subterminalen Enden des Transposons bindet,
wurde mit de- und wieder renaturiertem Protein erbracht (Kunze und
Starlinger, 1989). In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal TPase in
löslicher Form in E. coli exprimiert bzw. aus transgenen
Tabakpflanzen isoliert. Die Reinigung des Proteins bis zur
Homogenität war nicht möglich. Das lösliche Protein besitzt eine
hohe Aggregationsneigung. In vitro wurde gezeigt, daß die TPase als
Oligomer DNA bindet. Ein in vitro-Nachweis der endonukleolytischen
Aktivität der TPase konnte jedoch nicht erbracht werden. Die
Transposition von Ac läuft wahrscheinlich in einem synaptischen
Komplex ab, in dem über zahlreiche Proteininteraktionen die Enden
des Transposons in räumliche Nähe zueinander ge-bracht werden.
Dabei ist die TPase als Oligomer aktiv (Kunze et al, 1993).
Gleichzeitig unterliegt die TPase einer negativen Autoregulation.
Bei hoher TPase-Konzentration in der Zelle oligomerisiert das
Protein zu inaktiven Aggregaten. Die Transposition von Ac hängt vom
Vorhandensein mehrerer Proteininteraktionsdomänen ab. In dieser
Arbeit wurde eine C-terminale Dimerisierungsdomäne der TPase
charakterisiert, die unter den Transposasen der hAT-Elemente
hochkonserviert ist und sowohl an der Transposition als auch an der
negativen Autoregulation von Ac beteiligt zu sein scheint. Damit
ist es zum ersten Mal gelungen, einer der drei hAT-Domänen eine
Funktion zuzuschreiben. Am N-Terminus der TPase wurde eine
Oligomerisierungsdomäne identifiziert, die mehrere hydrophobe
„Zippermotive“ enthält. In vitro ist diese zum Teil ebenfalls
konservierte Domäne am Aufbau eines synaptischen Komplexes
beteiligt. Als weitere Proteininteraktionsdomäne der TPase wurde
die PQ-Domäne identifiziert, deren essentielle Funktion bisher
unbekannt war. Diese Domäne ist in vitro am Aufbau des
Transpososoms beteiligt, aber auch in die Ausbildung vermutlich
inaktiver TPase-Aggregate verwickelt. Als mutmaßliches
katalytisches Zentrum der Ac-TPase wurde durch Sequenzvergleiche
mit bakteriellen Transposasen und in vivo-Transposition
entsprechender Mutanten ein (N)DE-Motiv postuliert. Durch einfache
Aminosäureaustausche wurden dabei zum ersten Mal hyperaktive
TPase-Mutanten isoliert, die teilweise defekt in der
Aggregatbildung sind. Der Aktivitätstest der TPase-Mutanten
erfolgte unter anderem in einem neu entwickelten
Transpositionssystem in Hefe (Weil und Kunze, 2000).