Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die Cuabhängige dissimilatorische Nitritreduktase

Ziel dieser Arbeit war es ein serologisches Testystem für die
Beantwortung ökologischer Fragestellungen zur Denitrifikation zu
etablieren. Für den in situ-Nachweis der Expression des
denitrifizierenden Enzymsystems in Bakterien wurden spezifische
monoklonale Antikörper gegen die Cu-haltige dissimilatorische
Nitritreduktase (Cu-dNIR) entwickelt. Die für die Produktion der
Antikörper benötigte Cu-dNIR wurde mit Hilfe zweier Ansätze
präpariert. Der erste Ansatz, die Kombination verschiedener
Säulenchromatografien und Reinigung über eine Polyacrylamid-Matrix,
erlaubte das Enzym aus einem Bodenisolat von Ochrobactrum anthropi
mit einer Ausbeute von 2,5 µg/g Zellen (Feuchtgewicht) zu gewinnen.
In einem zweiten Ansatz wurde die Cu-dNIR aus Alcaligenes faecalis
S6 nach Fusion mit einem 6 x His-tag in E. coli exprimiert und
anschließend über eine spezifische Affinitätsmatrix aufgereinigt.
Hiermit konnte eine Ausbeute von 4,5 mg/l [2,25 mg/g Zellen
(Feuchtgewicht)] Bakterienkultur gewonnen werden. Mit der Cu-dNIR
der beiden Präparationsansätze wurden Mäuse immunisiert und nach
drei Zellfusionen 41 verschiedene Hybridomalinien etabliert, deren
sezernierte Antikörper in einem ersten Screening im
Chemolumineszenz-ELISA mit der für die Immunisierung benutzten
CudNIR reagierten. Hieraus wurden über weitere Screeningschritte im
Western-Blot zwei Antikörper zur genaueren Charakterisierung
ausgewählt: Ein sehr spezifischer Antikörper (mAkdNIR1a), der
ausschließlich die zur Immunisierung eingesetzte Cu-dNIR aus
Ochrobactrum anthropi 1a erkennt; und ein zweiter Antikörper
(mAkdNIR29) mit einem breiteren Reaktionsspektrum für Cu-dNIRs aus
Bakterien unterschiedlicher phylogenetischer Herkunft. Beide
Antikörper zeigten keine Kreuzreaktionen mit alternativen
dissimilatorischen Nitritreduktasen des cd1-bzw. Sirohäm-Typs aus
Pseudomonas aeruginosa bzw. E. coli. Die im Chemolumineszenz-ELISA
bestimmte Sensitivität für mAkdNIR1a liegt bei 2 ng Cu-dNIR. Mit
mAkdNIR29 konnte rekombinante Cu-dNIR bis 5 ng nachgewiesen werden.
Mit dem Antikörper mAkdNIR29 konnte eine Differenzierung zwischen
Reinkulturen von Alcaligenes faecalis S6, die unter
denitrifizierenden bzw. nicht denitrifizierenden Bedingungen
gewachsen waren, im Western Blot gezeigt werden. Weiterhin wurde
der zeitliche Verlauf der Expression von Cu-dNIR in Ochrobactrum
anthropi nach Shift vom aeroben in anaerobes Milieu mittels
Immunofluoreszenz mit makdNIR29 auf Einzelzellniveau verfolgt. Das
Maximum der Expression wurde nach 7 h erreicht. Der Verlauf der
Expressionsstärke folgt der Zunahme der N2O-Produktion pro
Zeiteinheit bezogen auf die Zellzahl. Die Expressionsrate der
Cu-dNIR ist am stärksten während der exponentiellen Wachstumsphase.
Die beiden anti-dNIR-Antikörper konnten in Kombination mit
Epifluoreszenz-und Laserscanning- Mikroskopie erfolgreich zur in
situ-Detektion der Expression von Cu-dNIR durch Immunofluoreszenz
in Reinkulturen und Umweltproben eingesetzt werden. Der Antikörper
mAkdNIR1a wurde wegen seiner Spezifität zum Nachweis von
Cu-dNIR-induzierten Bakterien an Wurzeln von Weizenpflänzchen
eingesetzt, die zuvor mit Ochrobactrum anthropi inokuliert worden
waren. Mit dem Antikörper mAkdNIR29 wurden Cu-dNIR-induzierte
Bakterien in Klärschlammproben aus zwei verschiedenen Kläranlagen
detektiert. Ein Protokoll zur simultanen Markierung von
denitrifizierenden Zellen von Ochrobactrum anthropi 1a mit dem
Antikörper mAkdNIR1a und einer rRNS-gerichteten Oligonukleotidsonde
wurde entwickelt. Immunofluoreszenzmarkierungen mit mAkdNIR29
ermöglichten die Trennung von Cu-dNIRinduzierten und
Cu-dNIR-nicht-induzierten Zellen von O. anthropi mittels
Durchflusszytometrie in zwei klar abgegrenzte Populationen.