Struktur-Funktionsbeziehungen der FhlA- und HydH/G-Regulationssysteme in Escherichia coli

Das σ54-abhängige Regulatorprotein FhlA aktiviert die Transkription
der für die Bildung eines funktionellen
Formiat-Hydrogen-Lyase-Komplexes nötigen Gene. Hierfür weist es
eine Reihe von Aktivitäten auf, nämlich ATP-Hydrolyse, Interaktion
mit Eσ54 und Stimulierung der Transkription. Die Aktivität von FhlA
wird durch Bindung von Formiat und von spezifischen DNA-Sequenzen
(UAS) stimuliert und durch HycA negativ beeinflußt.
Sequenzähnlichkeiten von FhlA zu anderen Transkriptionsaktivatoren
lassen auf einen Aufbau aus drei Domänen schließen. Die in der
vorliegenden Arbeit erfolgte Struktur- Funktions-Analyse lieferte
wichtige Ergebnisse über die Domänenstruktur und den
Wirkungsmechanismus von FhlA. In vivo- und in vitro-Analysen der
C-terminalen Hälfte von FhlA (FhlA-C, Aminosäuren 379 bis 693 von
FhlA), welche die Domänen B, C und D von FhlA umfaßt, zeigten, daß
dieser Teil von FhlA sämtliche für die Transkriptionsaktivierung
und ATP-Hydrolyse benötigten Bereiche enthält. Beide Aktivitäten
von FhlA-C sind konstitutiv, bedürfen also nicht mehr der
Aktivierung durch Formiat-Bindung. Durch die Bindung von DNA konnte
die Aktivität von FhlA-C jedoch gesteigert werden, wobei bei
spezifischer DNA ein stärkerer Effekt als bei unspezifischer zu
beobachten war. Aus den Ergebnissen wurde ein Modell abgeleitet, in
welchem die N-terminale Domäne von FhlA im nicht-induzierten
Zustand einen hemmenden Einfluß auf die Aktivität des restlichen
Proteins hat. Formiat-Bindung an die N-terminale Domäne hebt diese
Hemmung auf und bewirkt eine Steigerung der Aktivität von FhlA
durch Erhöhung der Affinität für ATP. Auch die HycA-Suszeptibilität
konnte der N-terminalen Domäne zugeordnet werden. Darüberhinaus
besitzt die N-terminale Domäne eine strukturelle Funktion, da sie
für die Oligomerisierung von FhlA verantwortlich ist. Es konnte
gezeigt werden, daß die Bindung von ATP an FhlA eine Änderung der
Konformation oder des Oligomerisierungszustandes des Proteins zur
Folge hat. Eine Studie zur Verbreitung des FhlA-Regulationssystems
ergab, daß in mehreren Spezies der Familie Enterobacteriaceae
sowohl ein zu FhlA orthologes Protein als auch Homologe zu hyc-
oder hyp-Genen existieren. Die Sequenz von fhlA aus S. typhimurium,
E. aerogenes und K. oxytoca wurde bestimmt. Sie zeigt über die
gesamte Länge große Ähnlichkeit zu FhlA von E. coli, wobei der Grad
der Identität der Gene und Proteine den phylogenetischen
Verwandtschaftsverhältnissen entspricht. Die FhlA-Orthologe aus E.
aerogenes und K. oxytoca können FhlA aus E. coli funktionell
ersetzen und zeigen auch in ihrer Aktivität hinsichtlich der
Stimulierbarkeit durch Formiat und Anaerobiose große
Übereinstimmung. Desweiteren beeinflußt auch HycA von E. coli die
Aktivität der orthologen Proteine, was wiederum die nahe
Verwandtschaft der Regulationssysteme zeigt. Im Hauptteil dieser
Arbeit konnte der Beweis erbracht werden, daß das HydH/G-Zwei-
Komponenten-System die Expression von zraP aktiviert, einem
stromaufwärts von hydH gelegenen, in divergierender Richtung
orientierten Gen. Für gereinigtes HydG wurde durch
Gelretardationsexperimente und DNase I Footprinting-Analyse eine
Bindestelle identifiziert, die im intergenen Bereich zwischen hydHG
und zraP liegt. Diese 55 bp lange Region umfaßt zwei jeweils 17 bp
lange Bereiche mit der Sequenz GAGTAAAAATGACTCGC, die als inverted
repeat angeordnet sind. Diese Bindestelle wirkt als UAS in beide
Richtungen. Als auslösender Stimulus für die Expressionsaktivierung
von zraP durch HydH/G konnte eine Zn2+-Konzentration im Medium von
mehr als 0,5 mM identifiziert werden. Pb2+ war zu einem gewissen
Grad in der Lage, Zn2+ in der Funktion als Induktor zu ersetzen,
jedoch erfolgte keine Aktivierung durch Ni2+, Co2+, Mn2+, Fe2+,
Mg2+, Cu2+, Cd2+ oder Hg2+. Gleichzeitig ist HydH/G einer positiven
Autoregulation unterworfen, die durch die gleichen Metalle
induziert wird. Sowohl für die durch HydH/G induzierte Expression
von zraP als auch von hydHG konnte eine Abhängigkeit von σ54
gezeigt werden. Der Einfluß von HydH/G auf die Regulation der Gene
für die Hydrogenase 3 tritt entgegen früherer Postulate nur bei
Überproduktion des Regulators auf und ist auf "cross-talk"
zurückzuführen. Zweidimensionale Gelelektrophorese erbrachte
Hinweise auf weitere durch HydG in ihrer zellulären Konzentration
beeinflußte Proteine. Obwohl zraP im Zusammenhang mit Zink-
Toleranz identifiziert worden war, zeigten die Ergebnisse keinen
Einfluß von HydH/G oder ZraP auf die Zink-Toleranz der Zellen.