Funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments und ihre Bedeutung für thylakoidale Signaltransduktionsprozesse

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die
Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer
photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten
Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe
molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als
auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates
ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen
Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung
von Thylakoidmembranproteinen und komplexe
Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller,
regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der
vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die
funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären
Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse
zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die
die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die
Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz
multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den
Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis
von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom
b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt.
Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S
renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine
Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder
Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem
monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner
Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter
Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der
phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten
LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme
bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler
Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle
von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht
aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist
unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente
in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird
diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit
dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle
Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran
identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der
photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und
elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den
ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit
seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als
Sensorkinase eines thylakoidalen
Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des
komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten
cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des
slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich
unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der
physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das
komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia
oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert,
wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten
Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte
Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am
C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des
potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal
verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen
Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der
Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des
charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls
vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper
gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34
kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das
der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins
widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des
Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins
beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das
mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von
TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen
"helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die
"South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante
TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in
vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in
vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen
DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines
Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner
Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems
bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der
N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des
rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe
von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten
Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit
komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war
in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom
b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran
assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die
Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im
Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und
einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A
untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im
Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran
aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem
unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur
Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden
verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40
hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper"
besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im
Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen
"freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro
durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des
"freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von
TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die
Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein
weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen
Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen
Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen
Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der
membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die
Stabilität, die Degradation und den Umsatz der
Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll,
wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder
die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana
L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle
cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den
gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die
physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im
Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.