Untersuchungen zur Regulation des Invasionsgens Urokinase-Rezeptor (CD87) durch den Tumorsuppressor Pdcd4 unter gleichzeitiger methodischer Neuetablierung eines quantitativen CAM-Assays

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen
Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte
Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst,
untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien
wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und
-Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von
Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach
gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige
Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene
cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren
dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich
potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen
für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245
bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten
Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über
Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben
werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten
Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie
innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der
Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert
neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der
Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert.
Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die
Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo
reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die
Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente
des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines
invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor
Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4
vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die
Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen
Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich
konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell
etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von
Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das
Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten
durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan-Probe in
Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane
Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese
Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen
Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier
entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit,
humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen
wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.