Zelluläre Rolle und molekulare Grundlagen des Endosomentransports in Ustilago maydis

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen
Grundlagen polaren Wachstums im phytopathogenen Basidiomycet
Ustilago maydis. Zunächst wurde die zelluläre Rolle des t-SNAREs
Yup1 analysiert. Ein temperatursensitiver Defekt im yup1-Gen hatte
zu Störungen in der Zelltrennung und im polaren Wachstum von
Sporidien geführt. Mutante Zellen bildeten dabei lange verzweigte
Ketten aus verdickten Zellen. Die Lokalisation eines
Yup1-GFPFusionsproteins auf beweglichen Organellen hatte zum
Aufstellen eines spekulativen Modells geführt, bei dem Yup1 auf
Endosomen die Fusion mit ankommenden endozytotischen Vesikeln
vermittelt. Eine erstmalige Charakterisierung der Endozytose von U.
maydis in dieser Arbeit zeigte, dass es sich bei den mit Yup1-GFP
markierten, schnellen Organellen tatsächlich um frühe Endosomen
handelte. Diese akkumulierten Zellzyklus-abhängig an Regionen
aktiven Wachstums in BSDs. Die Akkumulation früher Endosomen im
Apex von Hyphen war für das Spitzenwachstum erforderlich. In
yup1ts-Zellen war bei restriktiver Temperatur eine gestörte
Endozytose zu beobachten. Dieser Zusammenhang zwischen
Zellmorphologie und polarer Sekretion einerseits und Endozytose
andererseits deutete darauf hin, dass Membranrecycling über frühe
Endosomen entscheidend am polaren Wachstum von U. maydis-Zellen im
Speziellen und pilzlichen Hyphen im Allgemeinen mitwirkt. Mittels
des Yup1-GFP-Fusionsproteins konnten die molekularen Grundlagen der
beobachteten Bewegung von Endosomen untersucht werden. Es wurde
gezeigt, dass sich frühe Endosomen entlang von MT bewegen. Für
diese Bewegung war in erster Linie das Kinesin Kin3 verantwortlich.
Dieses Molekül ist ein neues Mitglied der Unc104/KIF1-Familie von
Kinesin-ähnlichen molekularen Motoren und bewegt als solches
vermutlich in Richtung der plus-Enden von MT.
Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass Kin3 in der Zelle als
Monomer vorliegt. Die N-terminale Motordomäne zeigte in vitro eine
MTstimulierte ATPase Aktivität. Ein Kin3-GFP-Fusionsprotein
lokalisierte in schnell beweglichen Flecken, die im
Bewegungsverhalten den frühen Endosomen glichen. Ein
Kin3-YFP-Fusionsprotein bewegte entlang von MT und kolokalisierte
zudem mit einem Yup1-CFP-Fusionsprotein auf Endosomen. Die Deletion
von kin3 führte zu einer starken Reduzierung der Endosomenbewegung.
Die in vivo-Untersuchung der MT-Dynamik im Δkin3-Stamm ergab, dass
der Großteil der Endosomen in Akkumulationen an den minus-Enden der
MT konzentriert war. Entsprechend führte die Überexpression von
kin3 zu einer verstärkten Konzentration der Endosomen an den
plus-Enden von MT. Die Zellform einzelner Sporidien war im
kin3-Deletionsstamm nicht verändert. Allerdings trennten sich die
Zellen nach der Teilung wie in der yup1ts-Mutante nicht
voneinander. Dieser Trennungsdefekt und ein verändertes
Knospungsmuster führten zur Bildung von großen Baum-ähnlichen
Zellaggregaten. Im Hyphenstadium führte die Deletion von kin3
außerdem zu einer deutlichen Störung des polaren Wachstums. Die
nach Deletion von kin3 beobachtete Restbewegung der Endosomen
beruhte fast ausschließlich auf der Aktivität des zytoplasmatischen
Dyneins von U. maydis. Das konventionelle Kinesin von U. maydis,
Kin2, zeigte ebenfalls einen Einfluss auf die Organisation und
Position endosomaler Akkumulationen, obwohl es vermutlich nicht
direkt am Transport einzelner Endosomen beteiligt ist. Die
präsentierten Daten zeigen, dass Endosomen MT- und
Zellzyklus-abhängig organisiert sind. Die Position der BSDs
korrelierte dabei mit Funktionen der Endosomen bei der
Zelltrennung, in der Bestimmung des Knospungsmusters und beim
polaren Wachstum. Da die MT während des Knospenwachstums unipolar
ausgerichtet sind, nutzt die U. maydis-Zelle das Wechselspiel des
plus-Motors Kin3 und des minus-Motors Dynein, um die Endosomen
Zellzyklus-abhängig an den plus- oder minus-Enden der MT zu
akkumulieren.