Na + -translozierende rotatorische Membranproteinkomplexe aus dem anaeroben Bakterium Acetobacterium woodii: Vergleichende molekulare und biochemische Analyse des Flagellums und der F1FO-ATPase

1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe
Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR
amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde
wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert,
sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten
DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene
Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine
Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch
Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren.
Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK)
gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A.
woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen
abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein
ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E.
coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert.
Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene
identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten
ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken
hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten
DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen
abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker
modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii
wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und
eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive
des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der
Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs
weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4.
Durch die elektronenmikroskopische Analyse der
Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A.
woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und
einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere
Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H +
-abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten
Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der
Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild
Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur
und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E.
coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na +
-F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die
Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die
Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli
produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch
Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A.
woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE
gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion
mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1,
c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na +
-F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der
Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre
Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die
Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8.
Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in
F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na
+ -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A.
woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8-
und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii
unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert.
Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten
atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein
Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer
Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase
wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch
Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine
Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte
Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der
gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare
Masse 600 kDa.