Etablierung von Mausstämmen defizient für die Selenoproteine mitochondriale Thioredoxin-Reduktase und Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathion-Peroxidase (PHGPx) und Charakterisierung einer Spermienkern-spezifischen Form der PHGPx

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im
Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für
Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der
kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei
Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die
Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der
Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das
ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale
Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der
Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in
der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur
PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor
oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die
sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz
beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und
bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der
funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise
nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung
des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen
zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3
erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die
Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser
Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen
keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass
homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder
perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in
Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie
sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren.
Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil
zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx
knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der
männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt,
dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe
dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen
PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die
beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein
Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens
zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das
Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des
alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von
den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen
neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den
vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die
Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx-
Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp
der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der
Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist.
Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der
Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu
ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen
knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch
wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für
die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele
zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und
Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die
Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird
in Kürze erwartet.