Untersuchungen zur Apoptose

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die
Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in
der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen
führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den
letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß
Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der
Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem
mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen
Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol
freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale
Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3)
beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare
Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten
„differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7
kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das
als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop)
besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine
81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein
3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20
µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante
mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm
und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis
fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt
werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in
murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei
27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von
11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert
wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig
von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop
mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner
Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3
bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht
in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der
intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das
mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC)
zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes
Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen
nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für
EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im
Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop
lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen
Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse
weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin.
Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation
von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der
mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen
Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden.
Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner
Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf
eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen.
Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine
Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen
Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde
Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten
weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix
hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert
ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae
vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der
pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu
definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c
(yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen
Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie
Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die
mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings
zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und
progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in
∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine
Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist,
ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen
DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die
Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt,
unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren
mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der
mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die
Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen
spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die
Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in
mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.