Der TOM-Core-Komplex und die kanalbildende Komponente Tom40 der Proteintranslokase der äußeren Mitochondrienmembran von Neurospora crassa

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport
cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die
mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran
erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden
Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von
zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die
Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der
Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden
in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus
Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch
charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes
identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit
Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser
Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den
Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber
dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und
Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa
und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6
von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu
8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische
Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische
Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm
Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit
Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen.
Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch
mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch
inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei
der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile
Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse
weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten
Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und
Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die
Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen
Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch
Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6
und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit
isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40
oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350
kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als
Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40-
Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der
Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein
kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40
ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu
bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot-
und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem
Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β
-Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40
zusammenwirken müssen.