Hydroxycinnamoyl-Transferasen für UV-B-Schutzpigmente in der Kiefer, Pinus sylvestris L.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den
UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten
Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies
verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei
Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung
sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und
der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in
mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben
Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der
Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und
Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten
Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit
wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen
Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die
Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die
Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in
drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der
Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden
folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein
physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von
Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume
im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in
Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein
proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme
und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und
die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen
in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt.
Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die
Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte
nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die
Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen
vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die
Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte,
dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der
UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der
4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In
Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt
werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde,
während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B
nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass
die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität
der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der
diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der
Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der
Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die
6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die
Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von
monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle
Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen
zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den
besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren
Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei
vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in
Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen
diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente
mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der
Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten
Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar
verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber
mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer
Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise
gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der
Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese
der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an
6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT
wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein
pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der
ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate
acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein
außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und
ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere
Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um
eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei
Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe
Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT
bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die
der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol
und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber
dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde
mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer
nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat
zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität
mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der
aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender
Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren
als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische
CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht
als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der
3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden
in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und
28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer
präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese
beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine
Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der
Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen
zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die
Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für
molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte,
enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf
Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen.
Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol
3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit
Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale
Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken
auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente
mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der
Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.