Molekulare Analyse der mRNA-Expression von Plasma-Prokallikrein

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives
Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in
den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum
aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der
Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der
Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale
Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb
der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort
ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem
extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale
Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser
Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und
pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK
aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer
quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem
Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des
Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert
werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der
Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen
gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die
regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert
werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die
PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben
quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im
Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben
zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine
ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der
PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem
Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI)
und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben
exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb
der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während
FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird.
Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in
Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche
mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels
Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was
für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei
Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der
PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK
und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren
Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate
in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor
abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das
PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor
3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in
den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um
eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels
der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und
Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert.
Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens
benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl
in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in
Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert,
die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten
und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden
PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die
Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell
ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein
Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die
RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten
Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter
Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion
(P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels
Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses
Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch
die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der
Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494)
und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die
Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch
die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng
gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle
spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK
293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens
transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber
auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit
können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell
aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der
PPK-Transkription ermöglicht wird.