Untersuchungen zur Charakterisierung der Zusammensetzung, Biogenese und des Mechanismus der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran von Neurospora crassa

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran
(TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von
mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die
mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der
Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten
Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der
Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten
TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden
zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des
Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert.
Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer
cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen
DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst
drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und
drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa
Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und
Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe
Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei
Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide
Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem
Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind
integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in
engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte
mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt
werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa
in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein
direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden,
welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein
weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora
crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser
Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits
bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in
vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende
TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den
generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import
von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte.
Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion
mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung
in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex
setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die
Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen
TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der
Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die
Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die
korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu
anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6
positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne
angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung
einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten
Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung
der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses
Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch
von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten
betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den
TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR
an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine
Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische
Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die
Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung
der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch
Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten
Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.