Heterologe Überexpression, Reinigung, biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur Struktur der A1 ATPase aus Methanosarcina mazei Gö1

1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG
wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia
coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt
isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die
spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten
AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden für die Studien dieser Arbeit
eingesetzt. 2.Die für die hydrophile Domäne der A1-ATPase
kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des
methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden in den
Überexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren
kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthält
zusätzlich 162 Bp stromaufwärts von ahaE 3.Die auf pTL2
lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und
die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische
ATPase-Aktivität im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSÖ1)betrug
186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten
AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG
konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem
Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)über Ultra-
zentrifugation,Ammoniumsulfatfällung,Gelfiltration an BioPrep SE
1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer
zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten
Homogenität gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare
Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen
Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65
kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9
kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und
wiesen im ATPase-Komplex eine Stöchiometrie von A3B3CDF auf.AhaE
und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer
wurde für die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM
MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH
5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte
A1-ATPase aus M. mazei Gö1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhältnis
2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein
und einem K von 1,3 ± 0,3 mM für ATP. 8.DES,Hexestrol und
Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archäellen
A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5
µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol
Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten
belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter
Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch für die Kopien der
Untereinheit AhaB und für die Untereinheiten AhaA und AhaB
untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der
Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase
besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase
ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer
zentralen Masse zusammen. 11.Die über Röntgenkleinwinkelstreuung
ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlänge =17,8
nm,Länge Kopfteil =9,4 nm,Stiellänge =8,4 nm, Stieldurchmesser =6
nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhängig vom Substrat)= 10,06
nm,Kopfradius (variabel,abhängig vom Substrat)=5,03 nm.
TPase,wohingegen sich alkoholische Lösungsmittel die
ATPase-Aktivität hemmten.