Untersuchungen proteolytischer Prozesse in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der
Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle
mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der
Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von
Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster
Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse
in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer
mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt.
Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts
vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der
i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease
wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere)
bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten.
Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese
Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische
Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden
Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der
Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse
durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines
molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen
Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen.
Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation
von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche
Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an
Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase
konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die
OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von
Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine
Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von
mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind,
führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der
Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder
Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die
AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit
wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den
Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln.
Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete
Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert
ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten
Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in
vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig
charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären
Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin-
Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen
Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von
Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen
beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt.
Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen
Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen
rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden
Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar
den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von
Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten
identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung
eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40
beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex
essentiell ist.