Chlorid, ein neues Signalmolekül für Bakterien

1. Der Aufbau des Membranpotentials und die ATP-Synthese in H.
halophilus wurden durch Cl- nicht beeinflußt. Zusammen mit den
Ergebnisse früherer Studien gibt es keinen Hinweis darauf, daß Cl-
an der primären Bioenergetik von H. halophilus beteiligt ist. 2. Es
wurde ein unter Hochsalzbedingungen induziertes, Cl--abhängiges
Transportsystem für das kompatible Solut Betain identifiziert und
charakterisiert. Dieses System transportiert Betain mit einer
maximalen Geschwindigkeit von Vmax.= 14,0 ± 0,2 nmol/min x mg
Protein und hat einen Km-Wert für Betain von 72,8 ± 10,4 µM. Die
Ergebnisse der durchgeführten Hemmstoffstudien deuten darauf hin,
daß die Betain-Aufnahme in H. halophilus über einen primären
Transportmechanismus erfolgt. 3. Die Beweglichkeit von H.
halophilus auf Weichagarplatten zeigt eine klare Cl--Abhängigkeit.
In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte festgestellt
werden, daß die Flagellenbildung in H. halophilus Cl--abhängig ist.
Das Flagellin wurde gereinigt, und es wurde ein spezifisches
Antiserum dagegen hergestellt. 4. Immunologische Analysen ergaben,
daß die Synthese des Flagellins Wachstumsphasen-abhängig war. In
der log-Phase und in der frühen stationären Phase wurden große
Mengen an Flagellin nachgewiesen, während die
Flagellinkonzentration in der späten stationären Phase zurückging.
Interessanterweise war die Flagellinsynthese zu jedem Zeitpunkt des
Wachstums Cl--abhängig; in Abwesenheit von Cl- war kein Flagellin
nachzuweisen. Dies ist der erste Nachweis einer Cl--abhängigen
Proteinproduktion in einem Prokaryonten. 5. Es wurde eine
Plasmid-Genbank aus chromosomaler DNA von H. halophilus generiert,
die 5807 Klone mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 4415
Bp enthält. Dies entspricht einer Wahrscheinlichkeit von 99,8%, daß
sämtliche Bereiche des Genoms von H. halophilus abgedeckt wurden.
Die für das Flagellin (fliC) und die β-Untereinheit der
F1FO-ATP-Synthase (atpD) aus H. halophilus kodierenden Gene wurden
mit Hilfe von Koloniehybridisierungen in der Genbank identifiziert.
Anschließend wurden Teile dieser Gene kloniert und sequenziert. 6.
Northern-Blot- und RT-PCR-Analysen zeigten, daß die Transkription
von fliC durch Cl- um den Faktor 2 stimuliert wird. Dies ist der
erste Nachweis einer durch Cl- stimulierten Transkription eines
Gens mit bekannter Funktion. 7. Versuche zur Substitution von Cl-
durch kompatible Solute ergaben, daß Glutamat, Succinat und Fumarat
die Cl--Abhängigkeit des Wachstums von H. halophilus aufheben
können. Für Glutamat wurde gezeigt, daß dies auf die nicht
Cl--abhängige Aufnahme von Glutamat zurückzuführen ist. Für die
Beweglichkeit und die Flagellinsynthese wurde gezeigt, daß Glutamat
Cl- nicht effektiv substituieren kann. 8. Mit Hilfe von
2D-gelelektrophoretischen Studien konnten 5 weitere Cl-- abhängig
synthetisierte Proteine in H. halophilus nachgewiesen werden. Die
Identifizierung dieser Proteine erfolgte durch N-terminale
Sequenzierung und nachfolgender Suche nach ähnlichen Proteinen in
Datenbanken. Zwei davon, YvyD und SodA, gehören zum σB-Regulon von
B. subtilis. YvyD ist von besonderem Interesse, da es als σ-Faktor
modulierendes Protein an der Cl-- abhängigen
Signaltransduktionskette, die von der Wahrnehmung des Reizes zur
Genexpression führt, beteiligt sein könnte. Ein drittes Protein
(YhfK) ist Aspartatund Glutamat-Semialdehyd-Dehydrogenasen sehr
ähnlich. Das vierte Protein ist der ATP-bindenden Untereinheit
verschiedener ABC-Transporter sehr ähnlich. Das fünfte
identifizierte Protein, LuxS, ist in Gram-negativen an der
Biosynthese von Autoinduktoren beteiligt. 9. Teile der Gene, die in
H. halophilus für YvyD bzw. LuxS kodieren, wurden mit Hilfe von
degenerierten Oligonukleotiden per PCR amplifiziert, kloniert und
sequenziert. 10. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, daß
11 von 44 darauf untersuchten Arten Gram-positiver und
Gram-negativer Bakterien eine Cl-- abhängige Osmotoleranz
aufweisen. Dies waren: Aeromonas hydrophila, Bacillus megaterium,
Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli,
Paracoccus denitrificans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Staphylococcus aureus, Thermus thermophilus und Vibrio fischeri.