Selenoprotein-Biosynthese in Archaea

Ziel dieser Arbeit war es, die aus der Genomsequenz von M.
jannaschii identifizierten Komponenten der Biosynthese und
Inkorporation von Selenocystein biochemisch und molekularbiologisch
zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: a) Die
tRNASec von M. jannaschii konnte mit gereinigter
Seryl-tRNA-Synthetase von E. coli korrekt in vitro mit L-Serin
beladen werden. Die Umwandlung der Seryl-Gruppe in eine
Selenocysteyl-Gruppe war mit gereinigter Selenocystein-Synthase und
Selenophosphat- Synthetase von E. coli ebenfalls erfolgreich. In
Extrakten von M. jannaschii konnte darüber hinaus die
Selenocystein-Synthase-Aktivität nachgewiesen werden. Eine
rekombinante tRNASec von M. maripaludis, bei der eine Base im
Anticodon-"Loop"ausgetauscht worden war, konnte im heterologen Wirt
E. coli Selenocystein inserieren. b) Die Natur und die Lokalisation
des archaeellen SECIS-Elements konnte durch die heterologe
Expression eines Selenoprotein-Gens von M. jannaschii in M.
maripaludis bewiesen werden. Die heterologe Selenoprotein-Synthese
war dabei abhängig vom Vorhandensein und der strukturellen
Unversehrtheit des RNA-Elements in der 3'-nicht-translatierten
Region der Selenoprotein-mRNA. c) Die biochemische
Charakterisierung des heterolog in E. coli überproduzierten MJ0495-
Proteins von M. jannaschii ergab Dissoziationskonstanten für
Guanin-Nukleotide, wie sie für bakterielle SelB-Spezies typisch
sind. Darüber hinaus diskriminiert das MJ0495-Protein zwischen der
kognaten Ser-tRNASec und Sec-tRNASec; letztere wird mit höherer
Affinität gebunden. MJ0495 stellt deshalb den
Selenocystein-spezifischen Translationsfaktor in Archaea (aSelB)
dar. Das in der nicht-translatierten mRNA-Region liegende
SECIS-Element wird allerdings (im Unterschied zu SelB von E. coli)
nicht von aSelB gebunden. d) Es konnten mehrere SECIS-bindende, und
ein aSelB-bindendes Protein identifiziert werden, die
möglicherweise für die notwendige Kommunikation zwischen aSelB und
dem SECISElement sorgen. e) Durch die Proteomanalyse konnte gezeigt
werden, dass in M. maripaludis einige Proteine in Abhängigkeit von
der Selenversorgung gebildet werden. Dabei wurden auch solche
Proteine selenabhängig synthetisiert, die kein Selenocystein
enthalten.