Charakterisierung eines Typ III-Sekretionssystems für Virulenzproteine aus Salmonella typhimurium

Zur Strukturanalyse des Typ III-Sekretionssystems, kodiert von der
Salmonella- Pathogenitätsinsel 2, wurden polyklonale Antikörper
gegen rekombinante Proteine des Sekretionsapparates erzeugt. Zur
Entfernung unspezifischer Bindungen wurden die polyklonalen
Antiseren an eine CNBr-aktivierte Sepharose 4B, gekoppelt mit
Salmonella- Lysaten, präadsorbiert. Anschließend konnten die
Antiseren für verschiedene Immunoblotanalysen eingesetzt werden.
Durch eine Membranfraktionierung mit N-Lauroyl-Sarcosin konnte die
subzelluläre Lokalisation der Apparatsproteine SsaC, SsaN, SsaV und
SsaB bestimmt werden. Dabei wurde SsaC in der äußeren, SsaN und
SsaV in der inneren Membranfraktion nachgewiesen. SsaB war nur in
der löslichen Fraktion detektierbar. Um mögliche Proteinkomplexe
innerhalb des Sekretionsapparates zu identifizieren, wurde der
membranpermeable Quervernetzer DSS eingesetzt. So konnten für das
Sekretin-bildende Protein SsaC und für das putative
Translokatorprotein SseD oligomere Strukturen nachgewiesen werden.
Bei der Untersuchung der Effekte von Mutationen in verschiedenen
SPI2-Genen auf die Synthese einzelner Proteine des
Sekretionsapparates wurde deutlich, dass das Zwei-
Komponenten-Regulationssystem SsrAB sowie alle untersuchten
Apparatsproteine eine essentielle Rolle in der Synthese bzw. im
Aufbau des Sekretionsapparates spielen. Lediglich eine Mutation in
ssaV oder ssaG hatte einen weniger starken Effekt auf die Synthese
der Apparatsproteine, so dass SsaC in Wildtyp-Mengen detektiert
werden konnte. Darüber hinaus wurde die Synthese einzelner Proteine
des Sekretionsapparates auch in Abhängigkeit des pH-Wertes
analysiert. Nach einer Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 nahmen
die Proteinmengen weitaus stärker zu als ohne pH-Wert-Veränderung.
Dabei konnte nachgewiesen werden, dass dieser Unterschied in den
synthetisierten Proteinmengen, in Abhängigkeit des pH-Wertes, nicht
auf eine verstärkte Transkription zurückzuführen ist und dass es
sich um einen SPI2-spezifischen Effekt handelt. Die Kinetik des
Aufbaus des Sekretionsapparates wurde anhand der Sekretion des
putativen Translokatorproteins SseB bestimmt. 1 h nach der
Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 wurde eine intrazelluläre
Akkumulation von SseB detektiert. Zu diesem Zeitpunkt konnte kein
SseB auf der Zelloberfläche lokalisiert werden. Eine Sekretion von
SseB wurde erst 3 h nach der Säure-Induktion beobachtet. Demzufolge
muss der Sekretionsapparat in diesem Zeitraum vollständig aufgebaut
und funktional intakt sein, um die pH-induzierte Sekretion zu
ermöglichen. Das SPI2-Protein SsaB (SpiC) ist für die Sekretion der
putativen Translokatorproteine SseB und SseC erforderlich. So
könnte SsaB eine Komponente des Typ IIISekretionsapparates
darstellen oder die Funktion eines Chaperones für die
Effektorproteine, bzw. eines GSP-spezifischen Chaperones für das
Sekretin-bildende Protein SsaC besitzen. Ebenso wäre es möglich,
dass SsaB für die korrekte Lokalisation von SsaC in der äußeren
Membran verantwortlich ist. Aus S. typhimurium konnten die als
Nadel-Komplexe bezeichneten makromolekularen Strukturen, die den
gesamten Sekretionsapparat darstellen, isoliert aber nicht
eindeutig identifiziert werden. Da in einer SPI1-Mutante, die einen
Defekt im Typ IIISekretionsapparat hat, keine Nadel-Komplexe mehr
angereichert werden konnten, liegt die Vermutung nahe, dass es sich
bei den Nadel-Komplexen, isoliert aus S. typhimurium- Wildtyp, um
die SPI1-Strukturen handelt.