Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen
Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika
einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen
medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der
Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist
die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem
Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1
(pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in
unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der
Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom
isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im
Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In
der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine
Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs
monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und
die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der
Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie
immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei
konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten
Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge
signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus
Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist
somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus
Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und
Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren.
Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine
PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen
Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen
zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit
bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus
den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die
PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms
vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit
den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als
zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte
gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen
Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion
von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und
zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in
einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der
klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der
PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie
ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die
PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere
Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den
stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen
konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem
TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay)
gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den
PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem
Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1-
Transfektanten signifikant gegenüber der
Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen
auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde
nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two
hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten
Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank,
zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1
interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47-
Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei
dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth
inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden
mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in
Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass
eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob
die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von
PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das
Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen
Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in
den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im
Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression
schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden
Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der
Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression
und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten
Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim
Melanom.