Molekulare, physiologische und biochemische Charakterisierung der Genfamilie für 4-Cumarat:Coenzym A Ligase aus Sojabohne (Glycine max L.)

Die 4-Cumarat:Coenzym A Ligase (4CL) ist ein Enzym des allgemeinen
Phenylpropanstoffwechsels, das aktivierte Hydroxyzimtsäure-Ester
zur Synthese spezifischer Phenylpropanoide bereitstellt. In vielen
Pflanzen kommen strukturell und funktionell sehr ähnliche
4CL-Isoformen vor, weshalb diesem Enzym dort nur eine beschränkte
regulatorische Funktion bei der Verteilung der unterschiedlich
substituierten Zimtsäurederivate für nachfolgende Synthesen
zugesprochen wird. Durch Isolierung der cDNA der von Knobloch und
Hahlbrock (1975) partiell gereinigten Ligase 1 und der
Vervollständigung der kodierenden Sequenz der Gm4CL4 konnte mit
großer Wahrscheinlichkeit die Genfamilie der Sojabohne-4CLs
komplettiert werden. Mit der cDNA der Gm4CL1 war außerdem erstmals
eine 4CL-Sequenz verfügbar, die für eine Sinapinsäure-umsetzende
4CL kodiert. Zusammen mit den bereits beschriebenen 4CL-Isoenzymen
2 und 3 (Uhlmann und Ebel, 1993; Möllers, 1997) existieren in
Sojabohne somit mindestens vier 4CL-Isoformen. Die
unterschiedlichen Substratspezifitäten der rekombinanten Proteine,
die Fähigkeit, die gesamte Gruppe der pflanzlichen
Hxdroxyzimtsäuren zu aktivieren und die differentielle Synthese der
Gm4CL-Isoformen nach Elicitor-Behandlung von Sojabohnezellkulturen
bzw. Infektion von Sojabohnekeimlingen weisen auf eine bedeutende
regulatorische Funktion der 4CL hinsichtlich der Bereitstellung
unterschiedlich substituierter Zimtsäurederivate zur Synthese
spezifische Phenylpropanoide in Sojabohne hin. Dabei scheinen
Gm4CL1 und Gm4CL2 vor allem an der Synthese von Phenylpropanoiden
beteiligt zu sein, die für Wachstum und Entwicklung der Pflanzen
benötigt werden, während Gm4CL3 und Gm4CL4 aktivierte Zimtsäuren
bereitstellen, die aufgrund von Umweltveränderungen benötigt
werden. Die 4CL wird mit Acyl-CoA Ligasen, Peptidsynthetasen und
Luciferase zur Familie der AMP-bindenden Proteine zusammengefaßt.
Diesen Enzymen ist nicht nur der Mechanismus der AMP-Aktivierung
gemeinsam, sondern sie besitzen auch Ähnlichkeiten in ihren
Proteinstrukturen. Durch Bildung von Hybridenzymen zwischen Gm4CL1
und Gm4CL3 konnte der zentrale Sequenzbereich der 4CL als
Substratspezifität-determinierende Region ermittelt werden. Mit
Hilfe der Informationen, die von der Kristallstruktur der
Phenylalaninaktivierenden Untereinheit der Gramicidin-S-Synthetase
gewonnen wurden, konnten vier mögliche Substratbindemotive der 4CL
identifiziert werden. Innerhalb eines dieser Motive unterscheidet
sich die Gm4CL1 von allen anderen bisher klonierten 4CLs durch den
Verlust eines Aminosäurerestes, wodurch die Gm4CL1 in der Lage ist,
hochsubstituierte Zimsäurederivate zu aktivieren. Wird der
entsprechende Aminosäurerest der Gm4CL2 (Gm4CL2dV345) und Gm4CL3
(Gm4CL3dV367) entfernt, können beide Deletionsmutanten Sinapinsäure
umsetzen. Außerdem ist Gm4CL3dV367 in der Lage,
3,4-Dimethoxyzimtsäure zu aktivieren und zeigt eine deutlich
erhöhte Affinität gegenüber Ferulasäure. Durch das Entfernen einer
einzigen Aminosäure können somit hochsubstituierte
Zimtsäurederivate umgesetzt werden. Die Möglichkeit, die
Substratspezifität dieses zentralen Enzymes des
Phenylpropanstoffwechsels zu modifizieren, eröffnet die Herstellung
transgener Pflanzen mit gewünschtem Phenylpropanoid-Profil.