CHLAMY 1, ein circadianes RNS-Bindeprotein aus Chlamydomonas reinhardtii

Die regulatorischen Fähigkeiten des RNS-Bindeproteins CHLAMY 1 aus
C. reinhardtii wurden unter Verwendung eines chimären
Reporterkonstruktes überprüft. Hierdurch konnte gezeigt werden,
dass ein in CHLAMY 1- angereichertes Proteingemisch die Translation
dieses Reporterkonstruktes in einem zellfreien System um
durchschnittlich 14,56 % reprimieren konnte. Durch eine
Molekularmassenbestimmung unter nativen und denaturierenden
Bedingungen wurde der Aufbau von CHLAMY 1 aus mehreren
Untereinheiten gezeigt. Der native Komplex hat eine Größe von ca.
160 kDa und besteht, ausgehend von den in dieser Arbeit
durchgeführten Experimenten unter denaturierenden Bedingungen, aus
den drei Untereinheiten C1 bis C3. Die Aufreinigung von CHLAMY 1
wurde in drei Schritten ausgeführt: (a) Herstellung eines
Rohextraktes, (b) Durchführung einer 0,5-1 M AS-Fällung und (c)
Ausführung einer spezifischen RNS-Affinitätschromatographie. Es
konnten dadurch drei für CHLAMY 1 spezifische Proteine mit den
Molekularmassen 60, 50 und 44 kDa aufgereinigt werden. Durch eine
Peptid-Sequenzierung wurden insgesamt neun Peptide mit einer Länge
von bis zu 24 Aminosäuren sequenziert. Hierbei wurde ein Peptid
identifiziert, das Bestandteil der zwei Untereinheiten C1 und C2
ist. In Western Blot-Analysen mit C. reinhardtii-Rohextrakten und
Peptid- Antikörpern wurde die Abundanz der CHLAMY 1-Untereinheiten
über einen Tag-Nacht-Verlauf bestimmt. Die Untereinheit C1 (60 kDa)
scheint konstitutiv exprimiert zu werden, wohingegen die Expression
von C3 (44 kDa) von der inneren Uhr kontrolliert zu sein scheint.
Durch die Sichtung einer Expressions-Genbank aus C. reinhardtii mit
Peptid- Antikörpern wurden zwei für CHLAMY 1 kodierende
cDNS-Fragmente isoliert und durch EST-Klone aus dem
Sequenzierungsprojekt von C. reinhardtii Richtung 5’-Ende
verlängert. Alle Peptide der Untereinheiten C1 und C2 konnten in
einer cDNS identifiziert werden, deren ORF für ein Protein von
51,73 kDa kodiert. Für die Untereinheit C3 wurde ein ORF
identifiziert, der für ein Protein der Molekularmasse 45,00 kDa
kodiert. In allen Proteinen wurden Regionen für mögliche
posttranslationale Modifikationen identifiziert. Im Rahmen dieser
Arbeit konnte gezeigt werden, dass „UG“-Bindeproteine auch in
anderen Organismen vorkommen. CHLAMY 1 kann spezifisch an die 16
„UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR der regA-mRNS aus V. carteri
binden. In dieser Kugelalge wurde außerdem ein RNS-Bindeprotein
(VOLVO 1) identifiziert, das spezifisch an diese „UG“-haltige
Region bindet. Im Pilz N. crassa konnte ein CHLAMY 1 analoges
Protein identifiziert werden (CRASSA 1), das an die sieben
„UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR von gs2wt aus C. reinhardtii
binden kann. Die Bindeaktivität in einem Tag-Nacht-Verlauf scheint
von der circadianen Uhr gesteuert zu werden.