Expression, Isolierung und Funktionsanalyse des OR5 Geruchsrezeptors: einem Vertreter der G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Die Familie der Geruchsrezeptoren ist zwar ein zentrales
Forschungsgebiet, dennoch ist wenig über sie bekannt. Im Folgenden
wird dargestellt, worin die beiden Hauptursachen für die
Problematik der Analyse von Geruchsrezeptoren bestehen und welche
Strategien in dieser Arbeit gewählt wurden, um einen
experimentellen Ansatz zur Untersuchung von Geruchsrezeptoren zu
finden: 1. Erst wenigen Geruchsrezeptoren konnten Liganden
zugeordnet werden . Da noch keine Struktur eines Geruchsrezeptors
bekannt ist, können bislang Modellvorstellungen nur über
Sequenzhomologien innerhalb der Rezeptorgruppe oder anhand
verwandter Rezeptoren, z. B. dem Rinderopsin, erstellt werden.
Offensichtlich reichen diese Modelle jedoch nicht aus, um effektiv
Liganden zuzuordnen oder Struktur-Funktion-Zusammenhänge zu
erkennen. Das HEK-293-Zellsystem erwies sich zwar als das bisher
effektivste heterologe Expressionssystem für diese Art von
Rezeptoren, doch auch hier ist die Zahl beschriebener, funktionell
exprimierter ORs begrenzt . Es gibt also nur wenige Möglichkeiten,
Geruchsrezeptoren funktionell zu exprimieren, und daher besteht ein
Bedarf an weiteren Expressionssystemen, um diese Rezeptoren in vivo
untersuchen zu können. 2. Neben der Problematik einer funktionellen
Expression gibt es bislang kein Expressionssystem, welches die
Herstellung geeigneter Mengen für eine Strukturaufklärung dieser
Rezeptoren ermöglicht. Die Menge der synthetisierten Rezeptoren ist
in der Regel zu gering oder die Zielproteinspezies liegt in
Einschlusskörpern vor. Zu 1) Die funktionelle Expression mit
korrekter Translokation des Membranproteins sollte in Kombination
mit einer Semliki Forest Virus-basierten Infektion in Säugetier
P19-Zellen durchgeführt werden. Ausgewählt wurde diese Zelllinie
aufgrund folgender Tatsachen: es handelt sich bei der P19-Zelllinie
um Teratokarzinom-Zellen, welche ursprünglich aus embryonalen
Stammzellen, implantiert in Hodengewebe, generiert wurden. Einem
Gewebe also, in dem in vivo eine Geruchsrezeptor-Expression
nachgewiesen wurde . Ein weiterer vielversprechender Umstand war
die Differenzierbarkeit dieser Fibroblasten-ähnlichen Zellen in
neuronale Zellen, dem Zelltyp, der auch in vivo für olfaktorische
Neuronen vorliegt. Dementsprechend lautet die Annahme, dass es sich
um eine optimale Zelllinie für die Expression rekombinanter ORs
handeln kann, die zur zeitgerechten Expression aller für die
olfaktorische Signalkaskade notwendigen Bestandteile befähigt ist.
Die Zelllinie sollte bezüglich ihrer Eignung als
Expressionsplattform für Geruchsrezeptoren charakterisiert und
Expressionsstudien am Beispiel des Rezeptors OR5 durchgeführt
werden. Zu 2) Die Überexpression des Membranproteins zur
quantitativen Isolierung erfolgte in Hefe. Gegenüber E. coli ist
der Hefeorganismus zur Durchführung posttranslationaler
Modifikationen fähig. Ein Vorteil im Vergleich zu Säugerzellen sind
die hohen erreichbaren Zelldichten. Primärgewebe kam für diese
Fragestellung nicht in Frage: eine Isolierung wäre mit sehr
geringen Ausbeuten verbunden, eine Problematik, die durch die
Verwendung von heterologen Expressionssystemen umgangen werden
kann. Es wurde eine „unfolded protein response“ (UPR)-kontrollierte
Expression in Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um zu
gewährleisten, dass überwiegend korrekt gefaltetes Rezeptorprotein
gebildet wird. Mit dieser Arbeit sollten erstmals durch eine
optimierte Expression, Produktion und Isolierung ausreichende
Proteinmengen des Geruchsrezeptors OR5 (aus R. norvegicus) mit
einer Homogenität von >90% zur Verfügung gestellt werden, um
biochemische und strukturelle Charakterisierungen durchzuführen.
Zusätzlich sollten monoklonale OR5-Antikörper generiert werden, um
eine spezifische Detektion und Immunopräzipitation des
Geruchsrezeptors OR5 zu ermöglichen. Zusammengefasst tragen die
etablierten Systeme dazu bei, die genaue Rolle der ORs in der
Geruchswahrnehmung in Zukunft entschlüsseln zu können. Mit Hilfe
der P19-Zelllinie wird die OR-Charakterisierung in einem
heterologen System ermöglicht, und durch den Gebrauch des
Hefeexpressionsystem und die optimierte Isolierungs-Strategie kann
das Material für eine Strukturaufklärung bereitgestellt werden.