Pseudomonas chlororaphis (pJP4) als effizienter Rhizosphäre-Kolonisierer: Untersuchung fitness-relevanter Faktoren und Etablierung einer in situ-Detektionsmethode

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene physiologische
Parameter hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kolonisierungs- und
Plasmidtransfereffizienz von P. chlororaphis SPR044 in der
Rhizosphäre von A. thaliana zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden
TnMod-Insertionsderivate mit Veränderungen
"Quorum-Sensing"-regulierter Funktionen untersucht. Darüber hinaus
sollten Auswirkungen von pJP4 auf die Fitness von SPR044
festgestellt werden. Weiterhin sollte eine Strategie zur in
situ-Detektion plasmid-tragender Stämme in der Rhizosphäre
entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Das
natürliche Isolat P. chlororaphis SPR044 produzierte BHSL,
3-OH-OHSL und ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Acyl-HSL.
Alle drei Acyl-HSLs wurden ebenfalls von den PCN-negativen
SPR044-Derivaten sowie vom PCN-Überproduzierer produziert, nicht
jedoch von den "Quorum-Sensing"-negativen Derivaten. Entsprechend
der regulatorischen Funktion der Acyl-HSLs zeigten quantitative
Analysen eine Korrelation zwischen der Menge von produzierten
Acyl-HSLs, antimikrobiellen Metaboliten und extrazellulären
Proteasen. Die einzige Ausnahme bildete der PCN-Überproduzierer.
Dessen PCN-Überproduktion basiert vermutlich auf einer Veränderung
des LPS und nicht auf der Ausschaltung eines negativen Regulators.
In Einzelkultivierungs-Experimenten zeigte sich nach 14 Tagen kein
Unterschied zwischen den Populationsgrößen des Wildtyps und der
Derivate. Nach 28 und 42 Tagen war die Population des Wildtyps
gleich groß wie die des PCN-negativen Derivats und signifikant
größer als die des gacS-negativen Derivats und des
PCN-Überproduzierers. In Kokultivierungs-Experimenten war die
Population des gacS-negativen Derivats hingegen stets gleich groß
wie die des Wildtyps. Eine Erklärung dieses Phänomens konnte durch
Untersuchung der Wachstumskinetiken in Flüssigkultur erbracht
werden. Die "Quorum-Sensing"-negativen Derivate wiesen eine stark
verkürzte Lag-Phase und eine reduzierte Produktion des für die
stationäre Phase spezifischen Sigmafaktors Rpos auf. Dies führte
nach Koinokulation mit anderen Bakterien offenbar zu einer
Aufhebung des selektiven Nachteils. Vermutlich nutzen die
gacS-negativen Stämme komplexe C-Quellen, die durch die Enzyme des
Wildtyps zugänglich gemacht werden und profitieren darüber hinaus
von der verkürzten Lag-Phase. Die Frequenz des konjugativen
pJP4-Transfers von SPR044 zu R. eutropha ist unabhängig von
"Quorum-Sensing"- und PCN-Produktion. Die Transformation mit pJP4
per se hatte keinen negativen Einfluss auf die
Rhizosphäre-Kolonisierungseffizienz von SPR044. Lag jedoch
zusätzlich abiotischer oder biotischer Stress vor, manifestierte
sich die metabolische Last durch pJP4 in einer verringerten
Populationsgröße. Dieser Effekt war unabhängig vom
"Quorum-Sensing"-System und der PCN-Produktion von SPR044. VirB5
von A. tumefaciens assembliert in einer höhermolekularen Struktur,
die durch Scherkräfte von der Zelle gelöst und mittels
Ultrazentrifugation sedimentiert werden kann. Bei verschiedenen
Reinigungsschritten wurde eine Kofraktionierung mit der
Haupt-Piluskomponente VirB2 beobachtet. VirB5 ist somit eine
Nebenkomponente des T-Pilus. Das homologe Protein TraC aus dem
IncN-Plasmid übt vermutlich eine ähnliche Funktion in
pKM101-determinierten Pili aus. Zellfraktionierung pJP4-tragender
P. chlororaphis-Zellen und Detektion mit spezifischen Antiseren
deuten darauf hin, dass TrbC und TrbF Haupt- und Nebenkomponente
pJP4-determinierter Pili sind. Bei TrbH handelt es sich um ein
membran-assoziiertes Lipoprotein. Die Detektion pJP4-tragender
Bakterien aus der Rhizosphäre war mit den TrbF- und
TrbH-spezifischen Antiseren in situ möglich. Das TrbF-spezifische
Antiserum ermöglichte die Erkennung IncP-Plasmid-tragender
Bakterien. Das TrbH-spezifische Antiserum ermöglichte eine
zusätzliche Unterscheidung zwischen IncPa- und
IncPß-Plasmid-tragenden Zellen. Eine Kombination der
Immunfluoreszenz-Analyse mit FISH erwies sich als geeignet für die
Detektion von pJP4-Transfer zwischen SPR044 und R. eutropha in der
Rhizosphäre von A. thaliana.