Das Proteom eines halophilen Archaeons und seine Antwort auf Änderung der Lebensbedingungen – Inventarisierung, Quantifizierung und posttranslationale Modifikationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an
Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei
unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die
Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D
Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen
aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine
etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine
wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im
Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des
zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf
Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die
massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven
Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation
herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von
experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere
Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und
Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger
Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte
für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale
DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält
und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte.
Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen
Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher
Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter
Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in
synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen
verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten
nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell
stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und
des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für
diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die
Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen
detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter
besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE
LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca.
40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten
werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen
Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen,
damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen
kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium
induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und
Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der
Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine
als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem
Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren
hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie
des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die
nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung
unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der
cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es
scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard
Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen
der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher
Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich
so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde
Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das
Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht.
Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung
phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang
es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin
Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich
jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum
eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen
handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte.
Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr
Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu
finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten
Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen
Modifikationen zu identifizieren.