Identifizierung und Charakterisierung von Proteasen der Photosynthesemembran

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem proteolytischen
System des Chloroplasten höherer Pflanzen und hier speziell mit dem
des Thylakoidsystems. Vorderstes Ziel war die Isolierung und
Charakterisierung neuer, bislang unbekannter Komponenten. Zu diesem
Zweck wurden zwei unterschiedliche Ansätze erprobt: Einmal der rein
biochemische Weg, bei dem der Versuch unternommen wurde, speziell
lichtinduzierte proteolytische Aktivitäten des Thylakoidlumens
nachzuweisen, anzureichern, und, falls möglich, aufzureinigen. Mit
dem zweiten Ansatz wurde zunächst versucht, in Sequenzvergleichen
auf molekularbiologischer Ebene homologe Gene zu bekannten
bakteriellen und cyanobakteriellen Proteasen im pflanzlichen Genom
ausfindig zu machen, und ausgehend von diesen dann die zugehörigen
Genprodukte zu isolieren und charakterisieren. 1. Nachweis,
Charakterisierung und Aufreinigung lichtstreßinduzierter Proteasen
des Thylakoidlumens: Die zu diesem Ansatz durchgeführten
Experimente konnten im Thylakoidlumen von Erbsenchloroplasten durch
den Einsatz von Aktivitätstests auf substrathaltigen
Polyacrylamidgelen mindestens fünf distinkte proteolytische
Aktivitäten sichtbar machen. Diese Aktivitäten erwiesen sich als
eindeutig induzierbar durch Hochlicht. Sie wurden jedoch sämtlich
durch in äußerst geringer Menge vorliegende Komponenten des Lumens
hervorgerufen. An der dadurch, sowie zusätzlich durch einen
Lichtadaptationseffekt des Pflanzenmaterials, bedingten schlechten
Reproduzierbarkeit der Aktivitäten scheiterten schließlich sowohl
die Charakterisierung der unbekannten Proteasen als auch deren
weitere Aufreinigung. Die Arbeiten sind dennoch dazu angetan, eine
Vorstellung von der Größe und Komplexität des proteolytischen
Systems alleine des Thylakoidlumens zu vermitteln. 2. Klonierung
der Gene neuer plastidärer Proteasen und Charakterisierung der
zugehörigen Genprodukte: Im Rahmen der Arbeit wurden die Gene
zweier zuvor nicht beschriebener mutmaßlicher Proteasen aus
Arabidopsis thaliana L. isoliert, beides Homologe zu bekannten
Proteasen aus E. coli. hhoA: Das Produkt dieses Gens stellt ein
Mitglied der ubiquitär verbreiteten HtrA-Familie von Serinproteasen
dar, deren Zahl sich in Arabidopsis auf mittlerweile vierzehn
beläuft. Es besitzt die typische katalytische Triade der Familie,
läßt jedoch die zumindest für die meisten charakterisierten
Homologe typische sogenannte PDZ-Domäne im N-terminalen Bereich
vermissen. In den Experimenten zur Kartierung des Gens konnte
gezeigt werden, daß dieses in singulärer Kopienzahl auf Chromosom
IV lokalisiert ist. Anschließende Untersuchungen zur Expression
konnten in Pflanzen jedoch weder unter normalen
Anzuchtsbedingungen, noch nach Streßexperimenten mit Hochlicht und
Hitzestreß ein spezifisches Transkript nachweisen. In
vitro-Experimente belegten die Transkribier- und Translatierbarkeit
des Gens; dessen Produkt im in organello-Importexperiment als
lösliche Komponente im Thylakoidlumen akkumulierte. Weitere
Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen aus Spinat und
Arabidopsis unter Zuhilfenahme eines gegen das heterolog
exprimierte gereifte Genprodukt produzierten polyklonalen
Antikörpers bewiesen, daß hhoA auch in vivo synthetisiert wird und
wie im Importexperiment im Thylakoidlumen lokalisiert ist.
Verschiedene Versuche zur Funktion des Proteins brachten kein
eindeutiges Ergebnis. Die Transformation von Arabidopsis mit
Sinnund Gegensinnkonstrukten des Gens war zwar erfolgreich,
erzeugte jedoch Pflanzen ohne erkennbar vom Wildtyp abweichenden
Phänotyp. sppA: Das Homolog zu der Signalpeptid-prozessierenden
Protease aus E. coli, Protease IV, stellt das bislang einzige
beschriebene in höheren Pflanzen dar. Das Gen ist, wie in
Experimenten zu seiner Kartierung gezeigt wurde, in singulärer
Kopienzahl im Genom vorhanden, lokalisiert auf Chromosom I. In
Untersuchungen zur Expression konnte das Transkript unter normalen
Anzuchtsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Bei Behandeln der
Pflanzen mit Lichtstreß über längere Zeit wurde jedoch ein nach
mehrstündiger Latenzzeit einsetzendes Ansteigen der Transkriptrate
beobachtet. Das Genprodukt wurde nach in vitro-Transkription und
-Translation im in organello-Importexperiment als peripher mit der
stromalen Oberfläche der Thylakoidmembran assoziiert
charakterisiert. Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen mittels
Antikörpern, die gegen den C-Terminus des heterolog exprimierten
SppA-Proteins produziert worden waren, bestätigten neben dem
Nachweis des Vorhandenseins auch unter Normalbedingungen diese
Lokalisation auch in vivo. Bei weiterer Subfraktionierung der
Thylakoide fand sich das Protein vornehmlich assoziiert mit
Stromathylakoiden. Die bei Bestrahlung der Pflanzen mit hohen
Lichtintensitäten steigende Expressionsrate deutet auf eine
funktionelle Neudefinierung von SppA in photosynthesetreibenden
Organismen im Vergleich zu E. coli und auf eine Rolle innerhalb der
langfristigen Adaptationsmechanismen der Pflanze gegen Lichtstreß
hin. Weitere Untersuchungen konnten jedoch keine eindeutigen
Hinweise bezüglich der spezifischen Funktion des Proteins liefern.