Analyse der Funktion von A-Ephrinen in der Entwicklung des Nervensystems an einem neu etablierten transgenen Mausmodell

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die
Ephrine, sind die größte Gruppe von axonalen Zielführungsmolekülen.
Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht
ausschließlich für die Etablierung neuronaler Konnektivität,
sondern auch für Entwicklungsvorgänge außerhalb des Nervensystems
wie die Ausbildung des Blutgefäßsystems und die Steuerung von
Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser
Molekülfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl
verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke
funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out
Experimente liefern daher nur ein unvollständiges Bild von der
Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von
Einzelmolekülen zumindest partiell von anderen Vertretern der
Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit
wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten
Nervensystem ein sezerniertes, Antikörper-ähnliches Fusionsprotein,
einen sog. Rezeptorkörper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte
der Rezeptorkörper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich
binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der
A-Ephrine überwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der
Rezeptorkörper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich
seiner Funktionalität charakterisiert. In einem zweiten Schritt
wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des
Rezeptorkörpers ersetzt (sog. knock-in), und nach
Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch
Rückkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische
Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkörper mit
dem räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im
zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in
Mauslinie charakterisiert. Die vollständige Deletion des
Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkörpers
wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ
Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und
immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem
rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise für eine
erhöhte prä- oder postnatale Letalität, und das äußere
Erscheinungsbild der Mäuse war weitgehend unauffällig. Eine erste
Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer
Färbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche
morphologische Veränderungen. Mit einem Immunassay wurde die
Gewebekonzentration des Rezeptorkörpers zu verschiedenen
embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf
subzellulärer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Färbungen
dissoziierter Neuronen demonstriert, daß der Rezeptorkörper nicht
auf das Soma der Zellen beschränkt, sondern auch in
Nervenfortsätzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf
spezifische Veränderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte
sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Rückenmark,
sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und
Blutgefäße. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen
Veränderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien
in das Rückenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem
knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen
in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung
von Extremitäten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und
dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgeprägt
war. Die Untersuchung der Blutgefäße im zentralen Nervensystem
adulter Mäuse mit Hilfe von Korrosionsausgüssen ließ in der Mutante
keine offensichtlichen Veränderungen erkennen. Mit Hilfe der in
Anwendung auf Mäuse neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical
Imaging“ wurde die Repräsentation der Retina im Primären Visuellen
Cortex juveniler und adulter Mäuse untersucht. Zentraler Befund
dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem
knock-in, die in jungen Mäusen erheblich stärker war als in adulten
Tieren.