Charakterisierung von Domänen des schnellen konventionellen Kinesins aus Neurospora crassa mit Hilfe C-terminal verkürzter und chimärer Mutanten

Konventionelle Kinesine sind Mikrotubuli assoziierte Motorproteine.
Sie benutzen die Energie der ATP-Hydrolyse, um gerichtete
Bewegungen entlang des Zytoskeletts zu ermöglichen. Tierische
konventionelle Kinesine sind aus zwei schweren Ketten und zwei
leichte Ketten aufgebaut. Die niederen Organismen, wie Pilze,
besitzen dagegen nur die zwei schweren Ketten. Das konventionelle
Kinesin des roten Brotschimmels Neurospora crassa (NcKin) bewegt
sich wie auch andere Pilzkinesine in vitro im mikroskopischen
Gleittest mit Geschwindigkeiten, die etwa drei- bis fünffach höher
sind (zwischen 2,0 und 2,6 µm/s), als die der tierischen Kinesine
(zwischen 0,2 und 0,8 µm/s). Trotz der hohen Sequenzähnlichkeit von
Tier- und Pilzkinesinen, sind spezifische Unterschiede festgestellt
worden, vor allem im Halsbereich. Weil es bisher keine zufrieden
stellende Erklärung der schnellen Gleitgeschwindigkeit von NcKin
gibt, liegt es nahe, in diesen pilzspezifischen Sequenzbereichen
die Grundlage hierfür zu vermuten. In dieser Dissertation wurde
daher untersucht, welchen Einfluss die einzelnen Kinesin-Domänen
auf die Motilität und den ATP-Umsatz haben. Zu diesem Zweck wurden
(i) bakterielle Expressionsvektoren hergestellt, die für C-terminal
verkürzte Kinesinkonstrukte kodieren. Hierbei wurden zunächst
rekombinante Motoren hergestellt, die an den Domänengrenzen
endeten, wie sie durch kristallografische Modelle und
Sekundärstrukturvorhersagen abgeleitet worden waren. Aufgrund der
Ergebnisse an diesen Proteinen wurden weitere C-terminal verkürzte
Kinesine konstruiert, die eine genauere funktionelle Kartierung der
Scharnierdomäne zum Ziel hatten. Mit diesen Konstrukten wurden
kinetische Studien durchgeführt, um ein Gesamtbild von deren
ATPase-Aktivität und Prozessivität zu bekommen. Da ähnliche Studien
an dem homologen Drosophila Kinesin durchgeführt worden waren, war
ein direkter Vergleich zu diesen Vertretern der Tierkinesine
möglich. (ii) Um den Beitrag der einzelnen Domänen zur hohen
Geschwindigkeit von NcKin zu ermitteln, wurden in einem zweiten
Teil der vorliegenden Arbeit gezielt NcKin Domänen in die
entsprechenden Bereiche des humanen Kinesins eingeführt, und die
entstandenen Chimären auf einen Geschwindigkeitszuwachs getestet.