Biogenese der spleißosomalen UsnRNPs

Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) sind Komplexe aus RNA und
Proteinen, die entscheidende Funktionen bei Prozessen wie
Translation, Telomer-Synthese, Protein-Import in das
endoplasmatische Retikulum oder RNA-Prozessierung übernehmen.
Obwohl stets neue Beispiele die Bedeutung von RNPs untermauern,
sind grundlegende Aspekte ihrer Funktion noch unklar. So stellte
sich zu Beginn dieser Arbeit die Frage, wie sich die Komponenten
von RNPs zu funktionellen Gebilden zusammenlagern. In frühen
in-vitro-Studien war beobachtet worden, dass sich RNPs spontan
ausbilden und dieser Vorgang keine weiteren Faktoren benötigt.
Daraus war die Hypothese abgeleitet worden, dass dies
möglicherweise auch der in vivo Situation entsprechen könnte.
Unerwartete Einblicke in die Biogenese von RNPs lieferten
schliesslich Studien zum "survival motor neurons"-Protein (SMN),
dem Krankheitsgenprodukt der spinalen Muskelatrophie. Antikörper
gegen SMN und seinem Bindungspartner Gemin2 inhibierten in Xenopus
laevis Oocyten die Ausformung von RNP-Untereinheiten des
Spleißosoms - den U snRNPs und nährten den Verdacht, dass diese
Proteine Hilfsfaktoren der U snRNP-Biogenese sein könnten. Das Ziel
der vorliegenden Arbeit war daher, mechanistische Details über die
Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo zu ermitteln und die Rolle
von SMN und Gemin2 zu untersuchen. Die wesentlichen Schritte der
Biogenese von U snRNPs können experimentell in X. laevis Oocyten
verfolgt werden. Nach dem Export der U snRNAs U1, U2, U4 und U5 in
das Cytosol lagern sich dort jeweils sieben sogenannte Sm-Protein
an ein gemeinsames Motiv der U snRNAs an und formen so die
Grundstruktur jedes U snRNPs, die Sm-Core-Domäne. Hierauf folgen
die Hypermethylierung der U snRNA-Kappe und der Import der
Sm-Core-Domäne in den Zellkern, wo sich U snRNP-spezifische
Proteine anlagern, ehe die reifen snRNPs am Spleißprozess
teilnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein
zellfreies System entwickelt, durch das die Zusammenlagerung von U
snRNPs in der Komplexität des Cytosols untersucht werden konnte.
Unter Verwendung von Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern oder
HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung der
Sm-Core-Domäne, entgegen bisheriger Vermutungen, nicht spontan
erfolgt, sondern Energie in Form von ATP benötigt. Aus
Depletionsversuchen wurde deutlich, dass SMN unter diesen
zellähnlichen Bedingungen für die snRNP-Biogenese unbedingt
erforderlich ist. SMN, dies zeigten immunbiochemische Reinigungen,
ist in der Zelle mit 17 verschiedenen Proteinen assoziiert, die
hier erstmals vollständig identifiziert wurden. Dieser SMN-Komplex
enthält bereits alle Sm-Proteine, jedoch keine U snRNAs. Anhand
direkten Sm-Protein-Transferstudien wurde klar, dass der
SMN-Komplex allein nicht nur notwendig sondern auch hinreichend für
die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, ist. Dennoch konnte mit dem
pICln-Komplex ein Proteinkomplex entdeckt werden, der mit dem
SMN-Komplex interagiert und dessen Aktivität erheblich steigert.
Der pICln-Komplex enthält eine neuartige Methyltransferase, die
Arginylreste in den Sm-Proteinen B/B’, D1 und D3 zu symmetrischen
Dimethylargininen modifiziert. Es ist bekannt, dass hierdurch die
Bindung von Sm-Proteinen an SMN verstärkt wird. Die vorliegenden
Daten weisen darauf hin, dass SMN- und pICln-Komplexe eine
funktionelle Einheit bilden, in der Modifikation und Transfer der
Sm-Proteine koordiniert ablaufen. Erste Erkenntnisse aus Versuchen
mit HeLa-Zellen und Patientenzelllinien deuten an, dass reduzierte
Menge des SMN-Komplexes mit einer reduzierten U
snRNP-Zusammenlagerungsaktivität einhergehen, und dass dies einen
biochemischen Defekt in Spinaler Muskelatrophie darstellen könnte.
In einem weiteren Projekt wurde mit Hilfe von Datenbankanalysen und
biochemischen Strategien das SMN-homologe Protein SMNrp
identifiziert und charakterisiert. Biochemische Studien zeigten,
dass SMNrp eine Komponente des U2 snRNPs ist und eine essentielle
Rolle beim Spleißen ausführt. Kernextrakte die kein SMNrp enthalten
wiesen einen Defekt der Spleißosomen-Zusammenlagerung auf der Stufe
des „prä-Spleißosoms“ auf. SMNrp ist demnach ein
Zusammenlagerungsfaktor des Spleißosoms und bezüglich dieser
Funktion dem U snRNP-Zusammenlagerungsfaktor SMN ähnlich.