Etablierung einer optimierten Helferzelllinie zum Genvektortransfer in humane B-Zellen

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft
Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber
die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie,
so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch
therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde
eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von
Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit
bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde.
Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem
ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen
CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung
durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die
Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die
hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die
große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion
und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV
episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV
ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten
Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom
entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das
Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen
verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der
Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das
EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und
seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich
bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der
Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die
B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser
Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden
Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum
Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und
Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense
suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte
eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und
zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere
Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter
anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP
von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion
von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten
Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt
wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker.
Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“
Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von
supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen
auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache
Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der
Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler
amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich
zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden
Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte
Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren
effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte
B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die
erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der
Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert
wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht,
wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit
Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach
Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis
lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig
neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet
werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der
Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen
lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden
Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche
der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem
Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt
übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von
antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten
auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach
Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und
das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen
Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die
zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten
Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als
Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden
kann.