Uncovering novel pathogenicity-associated loci among Yersinia enterocolitica species by subtractive hybridization

In dieser Arbeit wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung
angewandt, um neue Virulenzfaktoren zu finden, die spezifisch für
hochpathogene Yersinia enterocolitica Stämme sind. Hierfür wurde
die DNA eines nicht pathogenen „Treiber”-Stammes (Y. enterocolitica
NF-O, Biotyp 1A) gegen die DNA eines hochpathogenen
„Tester”-Stammes (Y. enterocolitica WA-314, Biotyp 1B) subtrahiert.
Mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung konnten verschiedene
Tester-spezifische Sequenzen ermittelt werden, die sowohl für
bereits bekannte als auch neue potentielle Virulenzmarker kodieren.
In dieser Arbeit konnte ein neues TypII-Sekretionscluster, genannt
yts1 (Yersinia TypII Sekretion 1), ermittelt werden. Das
yts1-Gencluster umfasst ein 13 kb großes Operon-ähnliches Modul,
welches die Gene yts1C-S enthält. Mittels reverser
Transkription/PCR konnte eine bevorzugte Transkription bei 37 °C
gezeigt werden. Southern Blot-Analysen sowie PCR haben gezeigt,
dass das yts1-Gencluster nur in den hochpathogenen Y.
enterocolitica Stämmen vorkommt. Dagegen sind yts1-Gene weder in
schwachpathogenen sowie apathogenen Y. enterocolitica Stämmen noch
in Y. pseudotuberculosis- und Y. pestis-Isolaten zu finden. Durch
Inaktivierung des yts1E-Gens in Y. enterocolitica wurde eine
Mutante hergestellt und hinsichtlich Mauspathogenität mit dem
Mutterstamm verglichen. Bei oraler Infektion der Mäuse erwies sich
die yts1E-Mutante als attenuiert (geringere Keimzahlen) in Leber
und Milz im Vergleich zum Mutterstamm. Im Gegensatz dazu konnte bei
intravenöser Infektion der Mäuse kein Unterschied zwischen Mutante
und Mutterstamm festgestellt werden. Dies könnte ein Hinweis darauf
sein, dass das TypII-Sekretionssystem die Erregerdissemination von
den Peyer-Plaques in Milz and Leber fördert. Das
yts1-Sekretionscluster grenzt stromabwärts an ein Gen, welches für
ein potentielles Chitin-Bindungsprotein (ChiY) kodiert. ChiY ist
ein mögliches Substrat des Yts1-Sekretons. Sequenzanalysen sagen
voraus, dass ChiY ein 55-kDa Protein mit zwei definierten
Chitin-Bindungsdomänen ist, von denen sich die eine Domäne am N-
und die andere am C-Terminus des Proteins befindet. Es konnte
gezeigt werden, dass rekombinantes ChiY Chitin bindet.
Sequenzanalysen des zugänglichen fast kompletten Genoms von Y.
enterocolitica 8081 (Biotyp 1B) führten zum Nachweis eines
möglichen zweiten TypII-Sekretionscluster, das in dieser Arbeit als
yts2 bezeichnet wird. Wie mittels PCR gezeigt werden konnte, kommt
yts2 - im Gegensatz zu Y. pseudotuberculosis und Y. pestis - in
allen getesteten pathogenen und apathogenen Y.
enterocolitica-Stämmen vor. Reverse Transkriptionsanalysen/PCR
zeigten, dass die yts2 - Gene bevorzugt bei 27 °C abgelesen werden.
Mittels subtraktiver Technik konnte auch ein neues
Insertionselement (IS1330) charakterisiert werden. Durch Southern
Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass IS1330 nur in pathogenen
Y. enterocolitica Serotypen vorkommt und somit für die
epidemiologische Typisierung dieser Spezies eingesetzt werden kann.
Diese Arbeit repräsentiert einen neuen Ansatz zur Aufklärung von
unterschiedlichen intraspezifischen Genomsequenzen von Y.
enterocolitica mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung, um unser
Verständnis der genetischen Vielfalt und Heterogenität dieser
bakteriellen Spezies zu erweitern. Das zum ersten Mal hier
beschriebene yts1-Cluster repräsentiert einen neuen Lokus, der eine
wichtige Rolle für die Pathogenese der hochpathogenen Y.
enterocolitica Stämme spielt.