Neue molekularzytogenetische Strategien für die Analyse seltener Zellen

Aufgrund fehlender Methoden wurde bis zum heutigen Zeitpunkt nur
selten eine molekulargenetische Analyse von Einzelzellen
durchgeführt. In vielen Bereichen aber, wie beispielsweise den
Tumoren, ist sie von entscheidender Bedeutung. Das Auftreten eines
genetisch heterogenen Musters in einem Tumor könnte die Suche nach
krankheitsauslösenden oder -fördernden Veränderungen erschweren.
Auch bei der Untersuchung von seltenen Zellen (so genannte „rare
cell events“), z.B. bei einer minimalen residualen Tumorerkrankung
sind geeignete Methoden zur Einzelzellanalyse notwendig, da nur
wenig Material zur Verfügung steht. Ziel dieser Doktorarbeit war
es, zwei molekulargenetische Analysemethoden zu etablieren,
weiterzuentwickeln und in einer geeigneten Strategie bei der
Untersuchung von disseminierten Tumorzellen bei fünf
Mammakarzinomen einzusetzen. Im ersten Teil der Doktorarbeit
erfolgte die Auswahl eines geeigneten Markierungssystems für die
Identifizierung disseminierter Tumorzellen im Knochenmark. Die
Benutzung des pan-Zytokeratin Antikörpers A45 B/B3 direkt
konjugiert mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 oder FluorX zeigte in
verschiedenen Testsystemen die besten Ergebnisse. Sowohl seine
Spezifität als auch die Durchführbarkeit einer
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) war möglich. Anhand
disseminierter Tumorzellen von Nierentumoren wurde die Möglichkeit
einer Untersuchung mittels zweier Interphase FISH Ansätze
überprüft. Die Hybridisierung der Zentromernahen YAC Sonden konnte
auf dem Knochenmarksgewebe bei pan-Zytokeratin positiven Zellen
nach Erproben mehrerer Protokolle nicht durchgeführt werden,
allerdings war die Hybridisierung von Zentromersonden erfolgreich.
Die Optimierung des veröffentlichten Protokolls zur Einzelzell CGH
(C. Klein et al. 1999; N. Stöcklein et al.2002) war das zweite Ziel
der Arbeit. Diese Optimierung war notwendig, weil sich das
ursprünglich publizierte Protokoll als Artefakt anfällig
herausstellte. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen
Protokollveränderungen konnte die für Einzelzell Analysen
notwendige Reproduzierbarkeit erreicht werden. Als Testsystem wurde
eine molekulargenetisch ausreichend charakterisierte und in ihren
Veränderungen stabile Zelllinie gewählt (RCC-26). Die ersten
Versuche zur Einzelzellanalyse zeigten Veränderungen in der
Zelllinie, die in allen vorangegangenen Analysen mit etablierten
Techniken (M-FISH und CGH) nicht gezeigt werden konnten. Eine
Optimierung des Protokolls führte zu übereinstimmenden Ergebnissen
von Einzelzell CGH, CGH und M-FISH. Anschließend konnte die
Reproduzierbarkeit dieser Methode anhand der Zelllinie RCC-26
gezeigt werden. Die Anwendung beider Methoden zur Analyse von
seltenen Zellen wurde mit der Untersuchung von fünf Mammakarzinomen
dargelegt. Der Vergleich von Primärtumor und kultivierten
disseminierten Tumorzellen ins Knochenmark zeigte im Rahmen der
untersuchten Fälle gemeinsame molekulargenetische Veränderungen
beider Tumorentitäten. Mit der Anwendung dieser neuen Methoden ist
es möglich detaillierte Informationen über seltene Zellen zu
erhalten und diese in den biologischen Kontext einzuordnen.