Das Membranproteom halophiler Archaea - Identifizierung und Quantifizierung

Membranproteine als Mediatoren zwischen extrazellulären Reizen und
intrazellulären Prozessen sind trotz ihrer enormen biologischen
Bedeutung in Proteomstudien meist unterrepräsentiert. Die
vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die kartierende und
quantitative Analyse des Membranproteoms am Beispiel der
Modellorganismen Halobacterium salinarum und Natronomonas
pharaonis. Grundlage war die Entwicklung einer optimierten
Membranisolierung für halophile Archaea unter Beibehaltung hoher
Salzkonzentrationen. Nach Zellaufschluss durch Beschallen wurden
die so generierten Membranvesikel über
Zuckergradienten-Dichtezentrifugation aufgereinigt. Es konnte
gezeigt werden, dass hohe Salzkonzentrationen nicht nur zur
Stabilisierung der Membran sondern auch der Membranproteinkomplexe
notwendig sind. Für die Analyse von halophilen
Membranproteinkomplexen wurde die Blue Native
Elektrophorese-Technik etabliert und adaptiert, sodass salzhaltige
Proben untersucht werden konnten. Anhand dieses Systems konnten
z.T. unbekannte Proteininteraktionen nachgewiesen werden. Da
integrale Membranproteine mit der klassischen 2D-Elektrophorese
nicht getrennt werden können, wurde für die zweidimensionale
gelbasierte Darstellung des Membranproteoms das 16-BAC/SDS-System
etabliert und bezüglich Trennleistung optimiert. Die
Identifizierung von Proteinsspots war für membranassoziierte
Proteine mit der peptide mass fingerprinting Methode erfolgreich,
diese Technologie ist jedoch für die Analyse von integralen
Membranproteinen stark eingeschränkt. Deren Inventarisierung
erfolgte über einen LC-MS/MS Ansatz. Die auch bei dieser Technik
beobachteten Schwierigkeiten konnten darauf zurückgeführt werden,
dass Peptide, die membranintegrale Bereiche repräsentieren,
spezifisch an langkettigen reversed phase Materialien verloren
gehen und sich daher einer Analyse entziehen. Aus diesem Grunde war
die Abreicherung membranassoziierter Proteine während der
Membranisolierung durch ein mildes Detergens entscheidend, sodass
integrale Proteine angereichert und der Analyse zugeführt werden
konnten. Durch einen 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Ansatz wurden so 50% des
vorhergesagten integralen Membranproteoms von H. salinarum und 32%
des integralen Membranproteoms von N. pharaonis identifiziert.
Damit war die Grundlage geschaffen, die Veränderungen im
Membranproteom von H. salinarum, hervorgerufen durch
unterschiedliches Energie- und Nahrungsangebot, zu untersuchen. Im
Rahmen dieser Arbeit wurde für die quantitative Membranproteomik
erstmals die differenzielle Gelelektrophorese (DIGE) mit dem
16-BAC/SDS-System kombiniert. Diese gelbasierte
Quantifizierungsstrategie ermöglicht nicht nur eine Übersicht über
das Ausmaß der Regulation des gesamten Proteoms, sondern auch die
Quantifizierung einzelner Proteinspots unabhängig von deren
Identifizierung. Mit einer grundlegend anderen,
massenspektrometrie-basierten Technologie wurden diese Ergebnisse
verifiziert und erweitert. Theoretische Berechnungen zeigten, dass
auch bei diesen Analysen die Quantifizierung integraler
Membranproteine erschwert ist, da wesentlich weniger Peptide pro
Protein als bei löslichen Proteinen für eine Quantifizierung zur
Verfügung stehen. Sie zeigten aber auch, dass die Markierung freier
Aminogruppen mit isotopenmarkierten Sonden, wie die
Nicotinoylierung (ICPL), für Membranproteine erfolgreicher ist, als
eine Cystein-basierte Markierungsstrategie. Mit Hilfe der
ICPL-Technologie, die in dieser Arbeit erstmals für Membranproteine
angewandt wurde, war es möglich am Beispiel von aerob und phototoph
kultivierten Zellen für 155 Membranproteine quantitative
Information zu erhalten, darunter 101 integrale Membranproteine.
Das am stärksten regulierte Protein war, wie zu erwarten, das
photosynthetisch aktive Protein Bacteriorhodopsin. Daneben konnten
weitere am aeroben und anaeoben Energiemetabolismus beteiligte
Proteine als reguliert identifiziert werden. Die insgesamt
überraschend geringen Regulationen auf Ebene des Membranproteoms,
welche sich sowohl aus der gelbasierten als auch bei der
massenspektrometrie-basierten Analyse ergaben, könnten eine
günstige Überlebensstrategie für Organismen in ökologische Nischen
mit geringem selektivem Druck darstellen.