Etablierung der DNA-Mikroarray-Transkriptom-Analyse für Halobacterium salinarum R1

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein
genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu
wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide
abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte
mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der
Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen
Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde
jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den
DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray
erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen
Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen
DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite
Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen
aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden
DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente
wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign
durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines
Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als
weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse
wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in
unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die
Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis
geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA
Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen
Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible
Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit
steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch
die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend
die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein
durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu
phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000
Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die
statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher
statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die
Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser
signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen
erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden.
Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist
kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die
Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion
aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen
ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher
charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die
Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H.
sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung
aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren
Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte
Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu
beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der
Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren.
Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein
möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und
Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von
Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die
Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA
(Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen
Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere
denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr
Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller
Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen
früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie
RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die
Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die
Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays
und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung,
bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der
Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer
bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten
Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die
Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die
bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere
Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form
zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die
DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu
beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das
phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen
Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem
späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene
Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und
damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen
schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als
Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung
haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden.
Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der
Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der
Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle
aufgestellt und verbessert werden.