Molekularbiologische und bioinformatische Analyse des Proteins KIAA0592/RISP und des dazugehörigen Gens

Risp wurde in einer früheren Arbeit in einem Hefesystem als ein
neues; mit HIV-1 Rev interagierendes zelluläres Protein
beschrieben, das dem C-terminalen Teil eines weitaus größeren
Proteins (KIAA0592) zu entsprechen schien. Die Zielsetzung der
vorliegenden Arbeit bestand darin, die Organisation des
KIAA0592-Gens zu untersuchen und die biochemischen und
strukturellen Eigenschaften des KIAA0592-Proteins zu ermitteln.Es
gelang erstmals das vollständige, KIAA0592komplett-Protein in
verschiedenen Zelllinien zu exprimieren und einem Promotorbereich
zuzuordnen. Somit konnten die in silico-Daten über das
Vorhandensein dieses Gens inklusive regulatorischer Bereiche
experimentell verifiziert werden. Es konnte anhand der verfügbaren
Datenbanken gezeigt werden, dass zu KIAA0592 homologe Proteine und
genomische Bereiche in den verschiedensten Spezies (H. sapiens, M.
musculus, R. norvegicus und C. griseus) konserviert sind. Dies
weist auf essentielle zelluläre Funktionen hin. Um mögliche
Funktionen des bisher nicht charakterisierten KIAA0592-Proteins zu
analysieren, wurden anhand der Aminosäuresequenz spezifische
strukturelle und funktionale Eigenschaften vorausgesagt. KIAA0592
enthält Transmembranbereiche, superhelikale „Coiled
Coil“-Strukturen und Bereiche für unterschiedlichste
posttranslationale Modifikationen. Es konnte durch in
silico-Sequenzanalysen und in vitro-Expressionsanalysen gezeigt
werden, dass das als Revinteragierend identifizierte Protein Risp
ein Teil des KIAA0592-Proteins darstellt. Bei der ursprünglich
identifizierten cDNA handelte es sich demnach um einen
unvollständigen Sequenzbereich von KIAA0592. Das erstmals in trans
exprimierte gesamte KIAA0592komplett-Protein zeigte eine starke
zytoplasmatische Lokalisation, wie auch die Risp-Domäne alleine. Es
wurde in einem Säugerzellsystem gezeigt, dass Risp Interaktionen
mit Rev und Crm1 eingeht und in der Lage ist, zumindest zu
dimerisieren. Für Rev ist bekannt, dass es ebenfalls mit dem
Kernexportrezeptor Crm1 interagiert, und dass diese Eigenschaften
essentiell für die Aktivierungsfunktion von Rev ist. Deswegen
wurden die Lokalisations- bzw. Transporteigenschaften der
Rev-interagierenden Proteindomäne (=Risp) von KIAA0592 und der
Einfluss auf die Aktivierungsfunktion von Rev untersucht. In den
verwendeten eukaryotischen Zelllinien lokalisiert Risp
hauptsächlich im Zytoplasma, es ist aufgrund der identifizierten
Import- und Exportsignale jedoch zum nukleozytoplasmatischen
Transport fähig. Diese Transportfähigkeit von Risp ließ sich auf
eine C-terminal deletierte Rev-Variante (Rev1-54) übertragen.
Trotzdem konnte durch diese Substitution die Funktionalität von Rev
nicht wiederhergestellt werden. Eine Crm1-Rekrutierung an Rev ist
offensichtlich nicht alleine ausreichend, ein funktionales RRE-mRNA
exportierendes Rev-Protein zu konstruieren. Es handelt sich bei
KIAA0592/Risp um ein Protein, das nicht nur HIV-1 Rev bindet,
sondern ebenso über strukturelle Komponenten verfügt und durch Crm1
mit dem Kernexport verbunden ist.