Die außergewöhnliche Diversität der der Proteolipide in Archaea: Multimere und monomere Rotoren mit sechs bis dreizehn Ionenbindestellen in A1AO-ATPasen

Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus
jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem
Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde
durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der
thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii,
Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter
marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen
methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit
Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die
MtrD-Untereinheiten der
Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase
extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler
Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die
molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu
21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit
der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine
triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also
3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate
sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen
Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein
Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen
würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M.
marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven
Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten
duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln
konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen
enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide
kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation
essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der
V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die
Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung
der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß
das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß
wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13
Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel
konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V-
und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an
Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt
vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus
denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch
Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der
bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der
A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet:
P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix
zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M.
jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert,
anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die
die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die
Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die
ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in
den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert.
Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur
Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren
gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren
spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt.
11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG
des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den
Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das
Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene
wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in
E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische
ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg
Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische
Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg
Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von
AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des
gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und
AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.