Transformation der Plastiden und Mitochondrien bei höheren Pflanzen - Selektive Marker und Einsatzmöglichkeiten

Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste
Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von
pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die
erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu
transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der
Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation
modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker
entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser
Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien
höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein
mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden
Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die
Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in
Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare
Plastidentransformation generelle Inhibitoren der
Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der
entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene
detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete
Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen
Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit
den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als
Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen
Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV
konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und
charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei
mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration
des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien
des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert
worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer
großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um
funktionelle zielortfremde Integrationen der
Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder
Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer
Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten
mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu
II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des
mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden
Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär-
bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer
korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes
in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A,
Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex
III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung
optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten
mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden
Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und
Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei
„particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der
Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente
Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des
mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung
nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale
Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In
diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der
offensichtliche selektive Vorteil der mit dem
Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die
Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des
mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte.
Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz
dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der
„feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des
Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven
dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt.
Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert.
Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt,
um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem
Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es
konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden,
die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden.
Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten
konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration
der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu
32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären
Transformanten. Es war damit erstmals mit der
Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese
zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC
(S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um
den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im
pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum
Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch
die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich
das Verhältnis von AEC Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin
in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil
nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem
Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3
selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre
Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es
ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell
einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In
weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen
„Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und
charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es
bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff
einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen
dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen
universellen Selektionsmarker zu etablieren.