Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung von CybL und Saip, zweier dominant apoptoseinduzierender Gene

Der programmierte Zelltod (Apoptose), ist ein evolutiv
konserviertes Selbstmordprogramm der Zelle, um auf äußere oder
endogene Signale zu reagieren. Es dient dazu, überflüssige und/oder
geschädigte Zellen zu entfernen. Dieser Prozess ist bei Krankheiten
wie z.B. Krebs teilweise außer Kraft gesetzt, und bei Parkinson-
oder Alzheimer-Erkrankung zu stark ausgeprägt. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden zwei Gene biochemisch und molekularbiologisch näher
charakterisiert. Bei diesen zwei Genen, die mit Hilfe eines
speziell zur Identifikation dominanter, Apoptose–induzierender Gene
entwickelten Screnningsverfahrens identifiziert wurden, handelt es
sich um CybL, eine Komponente von Komplex II der Atmungskette, und
um Saip (Small apoptosis inducing protein) einem Protein, das am
endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist. Bisher war
bekannt, daß die Atmungskettenkomplexe I und III bei der Fas-Ligand
und der Ceramid-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Über einen
Zusammenhang von Komplex II und Apoptose-Induktion war zu Beginn
dieser Arbeit nichts beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde
entdeckt, daß neben CybL kann auch noch die kleine Untereinheit von
Komplex II (CybS) Apoptose auslösen kann, wohingegen die übrigen
Komponenten von Komplex II, das Flavinprotein (FAD) und das
Eisen–Schwefelprotein (FeS), nicht in der Lage sind, Apoptose zu
induzieren. Die laut Datenbank vorhergesagten vier
Transmembrandomänen von CybL sind für die apoptoseinduzierende
Eigenschaft notwendig. Darüber hinaus führt nur eine 3,8–fache
Induktion von CybL über dem endogenen CybL zu Apoptose in
Säugetierzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt
werden, daß CybL einerseits bei Überexpression Apoptose induzieren
kann, und andererseits Apoptose durch seine Inaktivierung reduziert
wird. Daß CybL damit ein spezifischer Sensor für Apoptose ist,
konnte dadurch ermittelt werden, daß eine Reihe verschiedener
Apoptosestimuli (Doxorubicin, Etoposid, Menadion, Cisplatin, Taxol)
und der Fas-Rezeptor einen intakten Komplex II zur
Signalvermittlung benötigen. Dazu wurde mit sogenannten B9/B30
Zellen gearbeitet. B9/B30-Zellen sind Lungenfibroblasten aus
Hamsterzellen, in denen CybL inaktiv ist (B9), wohingegen die
B30-Zellen ein Fusionsprotein zwischen CybL und GFP enthalten,
welches die physiologische Aktivität von Komplex II
wiederherstellt. In den B9-Zellen ist die Apoptoseinduktion durch
Cytostatika (Ausnahme Arsentrioxid) bzw. durch den Fas-Rezeptor
reduziert, verglichen mit den B30-Zellen. Auch Untersuchungen an
HeLa WT- bzw. HeLa 0-Zellen (die keine intakte Atmungskette
besitzen) zeigten, daß für die Apoptoseinduktion mit den oben
genannten Reagenzien eine intakte Atmungskette benötigt wird. Im
Jahre 2000 wurde CybL als Tumosupressor beschrieben. Es ist daher
zu vermuten, daß die Tumorsuppressor-Eigenschaften von CybL auf der
Fähigkeit von Komplex II beruhen, proapoptotische Signale
aufzunehmen und weiterleiten zu können. Bisher war bekannt, daß
eine transiente Inhibition einiger Atmungskettenkomplexe (Komplex
I, II, III) zur Bildung von reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI)
führt. Es konnte gezeigt werden, daß auch CybL bei Überexpression
reaktive Sauerstoffintermediate produziert, und daß viele
proapoptotische Signale zur spezifischen Inhibition von Komplex II
führt. Da bereits eine geringe Expression von CybL ausreichend ist,
um Komplex II zu inhibieren, und dadurch Apoptose ausgelöst wird,
kann Komplex II als spezifischer Sensor für Apoptose angesehen
werden. Das bisher unbekannte Gen mit dem Namen Saip löst dominant
Apoptose in Säugetierzellen aus. Die proapoptotische Eigenschaft
von Saip ist vermutlich auf einen evolutiv konservierten
Mechanismus zurückzuführen, da auch ein Homolog aus C.elegans nach
transienter Transfektion in Säugerzellen Apoptose auslöst. Dabei
induziert Saip Caspase-abhängige Apoptosewege, die zur
Apoptose-typischen DNA–Fragmentierung und Bildung von apoptotischen
Körperchen (Membran blebbing) führt. Es konnte auch eine
physikalische Protein-Proteininteraktion (mittels
Co-Immunpräzipitation) mit Bap31 gefunden werden. Dieses Protein
ist ebenfalls am ER lokalisiert und Bestandteil eines lokalen
Apoptose-Sensors, der einen Proteinkomplex mit Procaspase-8L sowie
antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie (Bcl-2 bzw. Bcl-XL)
bildet. Des weiteren interagiert Saip auch mit einer
Deletionsmutante von Spike (Small protein with inherent killing
effect-SpikeN19), einem neuen proapoptotischen BH3-only Protein,
das ebenfalls am ER lokalisiert ist, und an Bap31 bindet. Saip ist
ein ubiquitäres Protein und wird in sehr vielen der getesteten
Gewebe und Zelltypen exprimiert. Im Northern-Blot-Verfahren konnte
vergleichsweise eine hohe Expression an humaner Saip-mRNA in Niere,
Placenta, Herz, Leber, Dünndarm und Skelettmuskulatur detektiert
werden. Mit Hilfe von weiteren Northern-Blots wurde herausgefunden,
daß Saip durch diverse Reagenzien, die bekanntermaßen Apoptose
induzieren können, transkriptionell hochreguliert wird. So ist zum
Beispiel das Signal von Saip nach 5-Fluorouracil-Behandlung (5FU),
um das 80-fache gegenüber der Kontrolle erhöht. 5FU ist ein sehr
effektives und bekanntes Zytostatikum, das in der Klinik zur
Behandlung von Colon- und Mammakarzinomen erfolgreich eingesetzt
wird. Wird Saip mittels der RNAi–Methode deaktiviert, wird die
5FU-induzierte Apoptose um 1/3 reduziert. Saip könnte somit eine
wichtige Rolle in der Behandlung von Tumoren spielen, die mit 5FU
therapiert werden.