Röntgenstrukturanalyse eines Aktin-Homologen Ta0583 aus Thermoplasma acidophilum und der UDP-Glukose Pyrophosphorylase aus Saccharomyces cerevisiae

Die Existenz eines Zytoskeletts galt lange als charakteristisches
Merkmal eukaryotischer Zellen. Obwohl sich mit der Entdeckung der
eubakteriellen Zytoskelettproteine MreB, ParM, FtsZ und CreS ein
Paradigmenwechsel vollzog, lagen bislang keine Erkenntnisse über
das Vorkommen von Zytoskelettproteinen in Archaeae vor. Der erste
Teil der Arbeit beschreibt die strukturelle und biochemische
Charakterisierung des Aktinhomologen Ta0583 aus dem Archaeon
Thermoplasma acidophilum. Die Kristallstruktur von Ta0583 wurde mit
der Methode der SAD-Phasierung bei einer Auflösung von 2,1 Å
gelöst. Ta0583 gehört zur Aktin/Hsp70 Superfamilie und besteht aus
zwei Domänen, die jeweils das Aktin/Hsp70 Kernelement enthalten.
Obwohl Aktin und das archaeale Ta0583 kaum Sequenzidentität
aufweisen, besteht eine deutliche strukturelle Homologie. Die
Struktur von Ta0583 kombiniert strukturelle Eigenheiten sowohl von
Aktin, als auch von den eubakteriellen Aktinhomologen MreB und
ParM. So konnte beispielsweise die strukturelle Ähnlichkeit der
Nukleotidbindungsstellen von Ta0583 und MreB in vitro durch den
Effekt des MreB-Inhibitors S-(3,4-Dichlorobenzyl)-isothioharnstoff
(A22) nachgewiesen werden, der die ATPase Aktivität von Ta0583
kompetitiv hemmt. Im Kristallgitter sind die Ta0583 Monomere in
Filament-ähnlichen Reihen angeordnet, in denen ähnliche
longitudinale Gitterabstände wie in den Protofilamenten von MreB,
Aktin und ParM vorliegen. In vitro bildet Ta0583 kristalline
Schichten, die ähnliche Gitterabstände wie die quasi-Filamente im
Kristall aufweisen. Die Bereitwilligkeit von Ta0583 zur
Kristallisation und zur Bildung kristalliner Schichten könnte eine
intrinsische Neigung des Proteins zur Bildung von filamentartigen
Strukturen andeuten. Das Vorkommen eines Aktin-Homologen im
Archaeon T. acidophilum gibt erste Hinweise auf das Vorkommen
möglicher Zytoskelettstrukturen neben Eukaryoten und Eubakterien
auch in der dritten Domäne des Lebens, den Archaeae. Der zweite
Teil der Arbeit befasst sich mit der strukturellen und
biochemischen Charakterisierung des in S. cerevisiae essentiellen
Stoffwechselenzyms Ugp1p, der UDP-Glukose Pyrophosphorylase
(UGPase). Die UGPase katalysiert die Synthese von UDP-Glukose,
einem zentralen Glykosyldonor im Stoffwechsel aller Organismen. In
S. cerevisiae ist die UGPase ein Oktamer aus identischen
Untereinheiten. Obwohl oktamere UGPasen schon in den 1960iger
Jahren erstmals charakterisiert wurden, blieb die strukturelle
Basis für die Assoziation der Monomere im Komplex bis heute
unaufgeklärt. In dieser Arbeit wurde die Struktur von Ugp1p durch
Molecular Replacement mit der Struktur einer monomeren UGPase aus
A. thaliana bei einer Auflösung von 3,1 Å gelöst. Das Ugp1p Monomer
besteht aus drei Domänen, einer N-terminalen Domäne, einer
katalytischen SGC-Kerndomäne und einer C-terminalen
Oligomerisierungsdomäne mit -Helix Motiv. Anhand der Struktur von
Ugp1p konnten mehrere Aminosäurereste identifiziert werden, die die
Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten im Oktamer vermitteln.
Diese vorwiegend hydrophoben Reste sind in den UGPasen von Tieren
und Pilzen konserviert, in den UGPasen der Pflanzen jedoch durch
polare und geladene Reste ersetzt. Aufgrund der Konservierung der
Reste im Bereich der Oligomerisierungs-Schnittstelle ist davon
auszugehen, dass alle UGPasen aus Metazoen und Pilzen
Ugp1p-ähnliche Oktamere bilden, pflanzliche UGPasen dagegen anders
aufgebaut sind. Während die Aktivität pflanzlicher UGPasen über
Assoziation und Dissoziation reguliert zu sein scheint (Martz et
al., 2002), sind UGPasen aus Metazoen und Pilzen nicht über
Oligomerisierung reguliert. So bildet Ugp1p ausschliesslich stabile
Oktamere. In Ugp1p scheint vielmehr das flexible N-terminale
Segment, das auch an Ser11 phosphoryliert gefunden wurde (Rutter et
al., 2002), die Regulation der Enzymaktivität zu vermitteln. Die
Struktur von Ugp1p bildet die Grundlage für gezielte
Mutagenesestudien an allen UGPasen aus Metazoen und Pilzen.