Etablierung eines stabil induzierbaren Protein Knockdown-Systems für b-Catenin in kolorektalen Tumorzellen und Identifikation von Dickkopf-4 als neues Zielgen des Wnt-Signalweges.

Ziel der Arbeit war die Etablierung RNA Interferenz basierender
Systeme zur Senkung der Proteinspiegel von b- und g-Catenin und die
darauf aufbauende Evaluierung potentieller b-Catenin Zielgene
mittels Microarray Technologie. Der Schwerpunkt sollte dabei auf
die Untersuchung von im Wnt-Signalweg beteiligten Genen gelegt
werden. Wir konnten in den kolorektalen Karzinomzelllinien SW-480,
DLD-1 und HT-29 mehrere voneinander unabhängige siRNA sowohl gegen
b- als auch g-Catenin etablieren. Dabei stand neben ausreichender
Senkung der Protein- und mRNA-Spiegel auch die Vermeidung
unerwünschter Effekte auf die Zellen im Mittelpunkt dieser
Etablierungsarbeit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten vier
neue funktionale Zelllinien etabliert werden. Sowohl in HT-29 als
auch in SW-480 konnte ein universell einsetzbarer TET-Repressor
stabil integriert werden. Die Linien HT-29TR und SW-480TR können
als Basis für induzierbare Expressionssysteme verwendet werden. Auf
Grundlage der Linie SW-480TR konnten Zelllinien etabliert werden,
die durch Doxycyclin vermittelte Induktion shRNA gegen b-Catenin
exprimieren. Mittels dieser Linien können Effekte, die durch die
Senkung der b-Catenin Proteinspiegel hervorgerufen werden, einfach,
schnell und zuverlässig in einem breiten Spektrum an in vitro und
in vivo Assays untersucht werden. Im Rahmen einer Microarray
Analyse des Transkriptoms von SW-480 Zellen nach RNA Interferenz
basierter Senkung der b-Catenin Proteinspiegel wurde DKK4 als sehr
stark reguliertes Gen auffällig. Mittels RT-PCR konnten wir
bestätigen, dass die Expression von DKK4 direkt von den
vorliegenden b-Catenin Proteinspiegeln abhängig ist. Basierend auf
einer in silico Analyse des DKK4 Promoters wurden mit Hilfe von
Reportergen Konstrukten der für die Aktivierbarkeit durch b-Catenin
verantwortliche Abschnitt des DKK4 Promoters bestimmt. Wir konnten
darstellen, dass die Aktivierung des DKK4 Promotors sowohl von der
Präsenz von b-Catenin als auch von TCF4 abhängt. Die Expression von
DKK4 bedingt die Gegenwart des aus TCF4 und b-Catenin bestehenden
Transaktivierungskomplexes, der für die Aktivierung Wnt-abhängiger
Transkription verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig stellt der DKK4
Promoter durch die Präsenz von TCF-Bindestellen eine Zielstruktur
für diesen Transaktivierungskomplex dar. Unsere Daten belegen, dass
DKK4 ein b-Catenin Zielgen darstellt. Wir konnten auflerdem zeigen,
dass die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription durch Gabe von
rekombinantem DKK4 gehemmt werden kann. Es konnte im Rahmen dieser
Arbeit dargestellt werden, dass die Expression des Wnt-Antagonisten
DKK4 in einen negativen Feedback Mechanismus, der durch b-Catenin
autoreguliert wird, eingebunden ist. Der vermutete Feedback
Mechanismus stellt sich wie folgt dar. Wnt-Faktoren aktivieren die
Transkription b-Catenin abhangiger Zielgene, darunter auch DKK4.
DKK4 initiiert durch Bindung an LRP und Kremen den Abbau von
b-Catenin und verhindert somit die weiterführende Transkription von
Wnt-b-Catenin Zielgenen. DKK4 übernimmt als autokriner Inhibitor
des Wnt-Signalwegs feinregulatorische Aufgaben, um bei moglicher
Bedarfsdeckung b-Catenin abhängiger Gentranskription die weitere
Aktivierung durch Wnt-Faktoren zu verhindern. Fur den Fall, dass
DKK4 als parakriner Inhibitor agiert, wäre es denkbar, dass DKK4
von Zellen im unteren Teil der Krypte, die in hohem Maße durch
Wnt-Faktoren aktiviert, werden sezerniert wird, um die darüber
liegenden Zellen durch Abschirmung von weiteren Wnt-Signalen vor
überschieflender Expression Wnt-b-Catenin abhängiger Gene und
Proliferation zu schutzen und die Differenzierung dieser Zellen
einzuleiten. Die unkontrollierte Expression von Wnt-b-Catenin
Zielgenen nimmt bei der Entstehung kolorektaler Karzinome eine
entscheidende Schlüsselposition ein. Zur Etablierung neuer
Diagnostik- und Therapieoptionen bedarf es daher auch der stetigen
Erweiterung des Verständnisses des Wnt-Signalwegs. Diese Arbeit
fügt ein weiteres Rädchen in die komplexe Mechanik dieses
Signalwegs ein.