Die Funktion der ABC-ATPase Rli1p in der Translation

Zusammenfassung: Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der
hochkonservierten, essentiellen ABC-ATPase Rli1p in Saccharomyces
cerevisiae aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass beide
Nukleotid-Bindungsdomänen und eine Scharnierregion, welche die
beiden ABC-Domänen miteinander verbindet, wichtig für die Funktion
von Rli1p sind. Des Weiteren konnte auch das N-terminale
Eisen-Schwefel Cluster Bindemotiv als essentielle Domäne
identifiziert werden. Durch Überexpression von inaktiven
rli1p-Proteinvarianten wurde ein dominant-negativer Phänotyp
erzeugt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Rli1p im Zytoplasma
lokalisiert ist und mit den Polyribosomen, den 80S Ribosomen und
hauptsächlich mit der 40S Untereinheit co-fraktioniert. Des
Weiteren konnte gezeigt werden, dass Rli1p mit einem Subkomplex des
Translationsinitiationsfaktors eIF3 und ribosomalen Proteinen
interagiert. Diese Interaktion ist abhängig von RNA und
funktionalen ABC-Domänen, sowie von eIF3j/Hcr1p, einer Untereinheit
des Translationsinitiationsfaktors eIF3. Um die zelluläre Funktion
von Rli1p näher charakterisieren zu können, wurde versucht eine
konditional temperatursensitive Mutante herzustellen und Rli1p
durch Repression der Transkription in vivo zu depletieren. Beide
Ansätze waren nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurden in vitro
Depletionssysteme etabliert. Immundepletion oder Inaktivierung
eines mit TEV-Protease spaltbarem Rli1p führte zu einer Reduktion
der Translationsaktivität und demonstrierte damit einen direkten
Einfluss von Rli1p auf die Translation. Eine vollständige
Inhibition der Translation einer Reporter-mRNA konnte durch Zugabe
eines a-RLI1-Antikörper erreicht werden, wobei die
Translationsextrakte einen Zerfall von den Polyribosomen und der
80S Komplexe in 60S und 40S Untereinheiten aufwiesen. Die
Immunoinhibition konnte durch die Zugabe von gereinigtem Rli1p
rückgängig gemacht werden. Neben einer biochemischen konnte auch
eine genetische Interaktion von RLI1 mit HCR1 nachgewiesen werden.
Durch Kombination eines Dhcr1 Knockout mit einem C-terminal
markierten Rli1p entstand ein synthetisch-temperatursensitiver
Phänotyp. Nähere Untersuchungen dieses Stammes zeigten eine
Reduktion von Polyribosomen und einen Defekt bei der 60S Bindung an
den Prä-Initiationskomplex, während die Ribosomenbiogenese nicht
beeinflusst wurde. Für die zelluläre Funktion von Rli1p konnte ein
Modell erarbeitet werden, in dem Rli1p den
Translationsinitiationsfaktor eIF3 auf dem 40S Ribosom assembliert
oder richtig positioniert. Diese Funktion des Rli1p könnte auch in
der Anti-Assoziation von 80S durch eIF1, eIF1A und eIF3 von
Bedeutung sein. Dieses Modell soll in Folgeexperimenten geprüft
werden und die Bindungsstelle von Rli1p im 43S
Prä-Initiationskomplex durch Cryo-EM näher analysiert werden.