Analyse von Protein-Protein Interaktionen im Typ IV Sekretionssystem von Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium,
das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV
Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA
(T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in
die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von
A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und
VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden
Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im
VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem
Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und
T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen
Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe
der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen
Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6,
VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus
Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE
und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter
Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der
T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit
VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung
und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes
Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen
Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von
4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu
Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der
Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen
Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3)
Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte
gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den
Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten
T-Pili detektiert.