Oxidativer Stress- assoziierter neuronaler Zelltod und die Identifikation neuroprotektiver Gene durch ein neuartiges Screening-System

In dieser Arbeit wurden mit Hilfe einer neuartigen
Screening-Methode im Hochdurchsatz-Maßstab Gene identifiziert,
welche einen Schutz vor dem bei Morbus Alzheimer assoziierten
oxidativen Nervenzelltod vermitteln können. Dazu wurde jeder Klon
einer cDNA Kollektion einzeln in klonale hippokampale Mausneuronen
der Zelllinie HT-22 transient transfiziert und die Zellen
anschließend mit einer toxischen Konzentration Wasserstoffperoxid
stimuliert. Nach Inkubation wurde der Anteil lebender Zellen als
Grad für den durch das transfizierte Gen vermittelten Schutz
bestimmt. Auf diese Weise konnten sechs Gene identifiziert werden,
welche HT-22 Zellen signifikant vor toxischen Konzentrationen von
Wasserstoffperoxid schützten. Vier der sechs Gene: Glutathion
Peroxidase-1, Peroxiredoxin-1, Peroxiredoxin-5 und Katalase,
kodieren direkt antioxidativ wirkende Genprodukte, deren
Identifikation die Funktionalität des Screening-Systems bestätigte.
Neben Genen, deren Proteintranskripte direkt antioxidativ wirken,
konnte des Weiteren der Transkriptionsfaktor Nrf2 und das Enzym
Glutamin: Fruktose-6-phosphat Amidotransferase-2 (Gfat-2)
detektiert werden. Nrf2 aktiviert die Transkription sog.
„antioxidant response element (ARE)“-regulierter Antioxidanzien und
detoxifizierender Enzyme, und wirkt somit indirekt schützend. Für
Gfat-2 war bisher noch kein direkter Zusammenhang für die
Protektion vor oxidativem Stress beschrieben. Mit der
Charakterisierung dieses Effektes wurde begonnen. Parallel zu
diesem Screening-Ansatz wurden Zelllinien generiert, die gegen
oxidativen Zelltod resistent sind. Als Modell dienten Mausneuronen
der Zelllinie HT-22. Von dieser Zelllinie wurden Klone isoliert,
die resistent gegenüber den oxidativen Substanzen Glutamat und
Wasserstoffperoxid sind. Untersucht wurde dabei die Genexpression
der resistenten Klone mit der der sensitiven parentalen Zellen. Der
Grad der Genexpression wurde dabei mit Hilfe von Affymetrix-Chips
untersucht. Getestet wurde inwieweit die Überexpression derjenigen
Gene, die in beiden resistenten Zelllinien eine verstärkte
Expression aufwiesen, einen Schutz in den sensitiven Zellen
gegenüber einem oxidativem Stress vermitteln konnte. Eine
Stichprobe von 25 Genen bestätigte dabei keinen Zusammenhang
zwischen starker Expression und funktioneller Protektion.
Zusätzlich wurde überprüft, ob die verminderte Sensitivität H2O2-
und Glutamat resistenter Zelllinien auf einen oxidativen Stress
eine verminderte Regulation Apoptose induzierender Gene mit sich
bringt. Ein Datenbankabgleich identifizierte neun Gene, die in
beiden resistenten Zelllinien vermindert exprimierten und deren
Überexpression in HEK 293 Zellen Apoptose induzierte. Insgesamt
konnte gezeigt werden, dass der in dieser Arbeit beschriebene
funktionelle Screening-Ansatz im Vergleich zu genomweiten
Expressionsanalysen deutliche Vorteile bei der Identifizierung von
Gen-Funktionen besitzt, ohne dabei Einschränkungen in der
untersuchten Probenzahl hinnehmen zu müssen. Die in beiden Ansätzen
identifizierten Gene, könnten als Ansatzpunkte für neuroprotektive
Wirkstoffe genutzt werden.