[NiFe]-Hydrogenasen von Escherichia coli: Funktionen der am Metalleinbau beteiligten Proteine

[NiFe]-Hydrogenasen besitzen in ihrem aktiven Zentrum neben den
namengebenden Metallen Nickel und Eisen die Nicht-Protein-Liganden
CO und CN. Die Synthese und der Einbau dieses NiFe(CN)2CO Zentrums
ist ein komplexer Prozess mit neuartigen bioanorganischen
Fragestellungen, an dem eine Reihe von Hilfsproteinen beteiligt
sind. Im Fall von Escherichia coli handelt es sich hierbei um die
sieben Reifungsenzyme HypA, HypB, HypC, HypD, HypE und HypF.
Zusätzlich bedarf es einer spezifischen Endopeptidase sowie ATP,
GTP und Carbamoylphosphat als niedermolekulare Substrate. Die
vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ablauf der
Hydrogenasereifung und der Charakterisierung der am Metalleinbau
beteiligten, akzessorischen Proteinen. Im Einzelnen wurden folgende
Resultate erzielt: 1. Die Funktion von HypA/HybF in vivo wurde als
die eines Metallochaperons bestimmt, was einhergeht mit der
Forderung nach Nickelbindung. Diese konnte experimentell
nachgewiesen werden. Das Auffinden von stöchiometrischen Mengen an
Zink sowie ein konserviertes Cysteinmotiv deuten auf einen
“Zinkfinger“ hin, der von struktureller Bedeutung für das
HybF-Protein ist. Ein Reifungsnetzwerk zwischen den drei
Hydrogenasen von E. coli wurde erstellt, welches eine Regulation
epistatisch zur Expression der Gene darstellt. 2. Die
Charakterisierung des HypD Proteins durch Mössbauer-Spektroskopie
ergab, dass es ein EPR-stilles [4Fe-4S]2+ Cluster enthält, welches
ihm die gelbliche Farbe und das typische UV-VIS Spektrum verleiht.
Die Bestimmung der Eisen- und Schwefelmenge im Wildtyp-Protein und
in HypD-Varianten verstärkten diesen Befund. Austausche der
konservierten Aminosäuren von HypD ergaben, dass ein C-terminales
Cysteinmotiv zur Stabilität des Proteins beiträgt, weshalb die
Cysteinreste als Liganden des FeS-Clusters vorgeschlagen wurden. 3.
Da Carbamoylphosphat (CP) für die Synthese der Cyanidliganden
notwendig ist, wurde ein CP-negativer E. coli Stamm näher
untersucht. Dabei wurde ein Proteinkomplex aus zwei Hilfsproteinen
(HypC und HypD) entdeckt, der ein Reifungsintermediat darstellt. 4.
Die am HypE-Protein synthetisierte Cyanidgruppe wird auf den
HypC-HypD Komplex übertragen. Dieser in vitro Befund führte zur
Aufstellung eines neues Reifungsmodels als Zusammenfassung dieser
Arbeit, wobei ein Gerüstkomplex zur Ligandensynthese postuliert
wird.