Diversität und Abundanz des Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO) -Gens cbbL autotropher Bakterien in Agrarböden

Autotrophe Bacteria sind von zentraler Bedeutung für den
terrestrischen Kohlenstoffkreislauf, da sie dem an verfügbaren
organischen Kohlenstoffverbindungen armen Boden Biomasse zuführen
und einen Beitrag zur Reduzierung des atmosphärischen CO2 leisten
könnten. Doch während die autotrophen Prozesse und die daran
beteiligten Mikroorganismen in aquatischen Habitaten bereits gut
untersucht und verstanden sind, besteht noch erheblicher
Forschungsbedarf zur Diversität und Abundanz autotropher
Bakterienpopulationen in Böden. In dieser Arbeit sollten zentrale
Fragen zur Charakterisierung der autotrophen Gemeinschaften mit
Werkzeugen der molekularen mikrobiellen Ökologie bearbeitet werden.
Die meisten Prokaryota, die mit CO2 als einzige Kohlenstoffquelle
zu wachsen vermögen, fixieren dieses über den Calvin-Benson-Bessham
Zyklus. Das Schlüsselenzym dieses Zykluses ist die
Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO). Die große
Untereinheit der Form I-RubisCO wird von dem Gen cbbL kodiert,
welches phylogenetisch in zwei Hauptentwicklungslinien unterteilt
wird: ‚green-like’ und ‚red-like’. Um einen Einblick in die
genetische Diversität CO2-fixierender Bakterien in unterschiedlich
gedüngten Agrarböden des Dauerdüngungsversuchs Ewiger Roggenbau in
Halle/Saale zu erlangen, wurde eine auf PCR basierende Methodik
entwickelt, die auf der Erfassung des Funktionsgens cbbL zielt. Es
wurden Datenbankrecherchen durchgeführt und mittels den
anschließenden vergleichenden Sequenzanalysen und phylogenetischen
Untersuchungen bekannter cbbL-Sequenzen spezifische
Oligonukleotid-Primerpaare konstruiert, die ausgewählte
cbbL-Sequenzen terrestrischer Bakterien der ‚red-like’ bzw. der
‚green-like’ RubisCO-Linien amplifizieren. Mit Hilfe dieser Primer
gelang es cbbL-Genbanken anzulegen, die mittels der
Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse und
Diversitätindices untersucht und verglichen wurden; ausgewählte
Sequenzen wurden einer phylogenetischen Zuordnung unterzogen. Mit
den entwickelten Primerpaaren konnten in den untersuchten Böden nur
eine geringe Diversität an ‚green-like’ cbbL-Sequenzen festgestellt
werden, die phylogenetisch zu den cbbL-Sequenzen von Nitrobacter
vulgaris und Nitrobacter winogradskyi nahe verwandt waren. Im
Vergleich dazu zeichneten sich die ‚red-like’ cbbL-Sequenzen aus
den Böden durch eine hohe Diversität aus, wobei sie phylogenetisch
über die gesamte ‚red-like’-Gruppe verteilt waren und sich häufig
als nur entfernt verwandt zu bekannten cbbL-Sequenzen
herausstellten. Während mit der RFLP-Analyse
Bodenbehandlungs-spezifische Muster identifiziert wurden, war nach
der phylogenetischen Sequenzanalyse keine Cluster-Bildung in
Abhängigkeit von der Bodenbehandlung zu beobachten. Um den
Datensatz an vorhandenen ‚red-like’ cbbL-Sequenzen zu erweitern,
wurden cbbL-Gene aus verschiedenen kultivierten α- und
β-Proteobacteria sowie aus Bakterienisolaten, die in dieser Arbeit
aus Boden gewonnen wurden, amplifiziert. Die phylogenetische
Sequenzanalyse gruppierte diese cbbL-Sequenzen Taxon-unabhängig zu
den verschiedenen Clustern des ‚red-like’-Baums einschließlich der
neuen cbbL-Gencluster aus den Halle-Böden. Bakterielle
Bodenisolate, die als cbbL-positiv identifiziert wurden, konnten
basierend auf ihrer 16S rDNA-Sequenz als Organismen der
Gram-positiven Gattungen Bacillus, Streptomyces und Arthrobacter
klassifiziert werden. Vertreter dieser bakteriellen Gruppen waren
bisher nicht als CO2-Fixierer charakterisiert worden. Der
physiologische Beweis eines aktiven CO2-fixierenden Metabolismus
über RubisCO steht noch aus. Die Ergebnisse der ‚red-like’
cbbL-Diversitäts-Studie dienten als Grundlage zur Konstruktion
weiterer Oligonukleotide, die in der „real-time“ TaqMan-PCR zur
Quantifizierung von ‚red-like’ cbbL-Genen aus Boden eingesetzt
wurden. Dabei wird ersichtlich, dass in den untersuchten
Bodenvarianten bis zu 107 cbbL-Genkopien/g Boden enthalten sind.
Die unterschiedlichen Bodenbehandlungen scheinen keinen Einfluss
auf die Abundanz von ‚red-like’ cbbL-Genen in Böden zu nehmen.